奥曲肽对大鼠急性胰腺炎腺泡死亡方式的影响

曹 勇 蔡 伟 黄林义 张中文

南京医科大学附属江宁医院普外二科 南京 211100

急性胰腺炎(Acute Pancreatitis，AP)是外科常见的急腹症，其发病机制的腺泡细胞凋亡学说近年来引人注目［1］，而奥曲肽对AP 的治疗效果已经得到临床普遍认可［2］，但其作用机理尚未完全清楚。本课题试图通过奥曲肽诱导胰腺腺泡细胞凋亡的角度，初步探讨其治疗胰腺炎的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂 SD 大鼠由南通大学实验动物中心提供，蛙皮素购自美国Sigma 公司，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL 试剂盒)、血清淀粉酶(AMY)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。TaqDNA 聚合酶及缓冲系统、蛋白酶K、脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)、Fluorescein -dUTP、RNA 酶抑制剂(rRNasin)由美国Promega 公司提供。

1.2 动物分组、模型制备 SD 大鼠30 只，雌雄不限，体质量250～300 g。将动物随机分为三组，每组10 只，试验前禁食不禁水12 h。(1)空白对照组。(2)急性胰腺炎组:麻醉后于大鼠后肢根部皮下注射蛙皮素15 g/只，1 次/h，共4 次。(3)急性胰腺炎治疗组:按奥曲肽0.001 mg/kg，后肢根部皮下注射，1 次/8h，制作AP 模型过程同［2］。

1.3 检测方法

1.3.1 血清AMY 检测 采用碘-淀粉比色法测定，细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸介导的dUTP 缺口末端标记(TUNEL)法。凋亡指数(Apoptotic Index，AI)计算方法:数4个高倍镜视野，每个视野中计算250个腺泡中凋亡细胞数。病理组织学评分标准按改良Schmidt 法［3］进行。

1.3.2 逆转录-多聚酶链反应(RT -PCR)检测 引物序列均由南京若尔曼生物技术有限公司合成，引物信息如下:

检测步骤:(1)总RNA 的制备。(2)RT 反应。(3)PCR 反应。(4)反应结束后进行PCR 产物电泳。

1.4 统计学方法 数据采用Stata7.0 版本进行统计学处理。测定数值以(±s)表示，数据间比较采用方差分析，两两比较采用q 检验，两者间相关关系采用直线相关分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胰腺组织内Bax mRNA 经逆转录-多聚酶链反应后检测的表达情况 结果以各组测得的光密度值与内参β -actin 的光密度值之比值表示，见表1。

表1 各组组织内Bax mRNA 表达 (±s)

表1 各组组织内Bax mRNA 表达 (±s)

注:#与正常对照组相比P ＜0.05;●与急性胰腺炎组相比P＜0.05

正常对照组(n=10)急性胰腺炎组(n=10)治疗组(n=10)Bax mRNA 0.2196±0.04466 0.3765±0.0566# 0.6959±0.0784#●

2.2 各组血清AMY 与各组病理组织学评分情况及胰腺组织细胞凋亡变化情况 治疗组血清AMY、病理组织学评分较AP 组均显著降低(P ＜0.05)，治疗组血清胰腺组织细胞凋亡指数较AP 组明显升高(P ＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠AMY 与TNF-α 水平变化情况 (±s)

表2 各组大鼠AMY 与TNF-α 水平变化情况 (±s)

注:#与正常对照组相比P ＜0.05;＊与急性胰腺炎组相比P ＜0.05

组别 n AMY(u/l) 细胞凋亡指数(AI%)病理组织学评分正常对照组10 604.90 ±114.89 1.45 ±0.33 0.90 ±0.74急性胰腺炎组 10 2235.81 ±466.52# 21.30 ±1.21# 8.20 ±0.79#治疗组 10 1342.33 ±222.92#＊ 28.79 ±1.43#＊ 3.80 ±0.92#＊

2.3 各检测指标间的相关分析 各组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡指数与胰腺组织病理学评分呈负相关，相关系数为r2= -0.97(P ＜0.05);各组大鼠胰腺细胞凋亡指数与胰腺组织内Bax mRNA 之间呈正相关，相关系数为r3=0.73(P ＜0.05);各组大鼠胰腺组织病理学评分与胰腺组织Bax mRNA 之间呈负相关，相关系数为r1= -0.54(P ＜0.05)。

3 讨论

急性胰腺炎(AP)的细胞凋亡学说是近年来研究AP 发病机制的又一个热点领域，该学说认为［1］:在AP 的发病过程中，胰腺腺泡细胞的凋亡同疾病密切相关，即腺泡细胞的凋亡是对机体较为有利的一种反应，其凋亡程度同AP 病情的严重程度呈负相关，胰腺细胞凋亡越多，则胰腺组织病理学损害越轻。本课题结果也显示:正常对照组腺泡细胞的凋亡细胞很少;AP经治疗后凋亡指数较同型明显上升，其组织病理学损害的减轻(P ＜0.05);AP 凋亡指数与胰腺组织病理学评分呈负相关(P ＜0.05)，进而验证了“细胞凋亡学说”观点。

奥曲肽(sandostatin)是人工合成的生长抑素的八肽衍生物，为治疗急性胰腺炎的主药，其疗效已为临床认可。通常认为奥曲肽治疗急性胰腺炎的作用机制包括以下多方面的［4-5］:(1)抑制胃肠道消化液和胰腺外分泌液分泌;(2)抑制内分泌激素的分泌、抑制胆囊收缩;(3)抑制炎性细胞因子的生成和释放;(4)使胆管括约肌张力降低，从而使胰管内压力下降;(5)改善胰腺炎患者血流动力学、机体代谢状态;(6)细胞保护作用;(7)减少液体丢失和在第三间隙聚集，降低严重并发症的发生率等。然而，奥曲肽对AP 的治疗作用机制中，是否涉及诱导腺泡细胞的凋亡、减轻胰腺组织病理学的损害，鲜有文献报道。

Bax 基因属于Bcl-2 基因家族。Bcl-2 基因家族是最受关注的细胞凋亡相关的基因，Bcl -2 家族可形成共聚体促进细胞凋亡［6］。以往有研究证实Bax 基因是一种凋亡调控基因［7］，转染Bax 基因后细胞的凋亡指数增高。促凋亡基因Bax 表达上调，必然使腺泡细胞凋亡增加，胰腺炎病情的严重程度减轻。通过本实验发现，奥曲肽治疗组与AP 组相比胰腺组织Bax mRNA表达水平明显增高(P ＜0.05)，且胰腺组织Bax mRNA 表达水平与其细胞凋亡指数呈显著正相关(P ＜0.05)，凋亡指数亦明显增高(P ＜0.05)，提示奥曲肽对大鼠急性胰腺炎的治疗作用可能还通过诱导AP 腺泡细胞的凋亡这一途径，进一步减轻AP 的病情。

［1］Leindler L，Morschl E，Laszlo F，Mandi Y，Takacs T，Jarmai K，Farkas G. Importance of cytokines，nitric oxide，and apoptosis in the pathological process of necrotizing pancreatitis in rats［J］. Pancreas，2004，29(2):157 -161.

［2］Zhou Liming，Wan Lihong，el a1. Effect of emodin on experimental acute necrotics pancreatitis in rat ［J］. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 2006;22 (2)15-16.

［3］Schmidt J，Lewandrowsi K，Warshaw AL，et al. Morphometric characteristic and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat［J］. Internat J pancreatol，1992，12(3):41 -51.

［4］Uhl W，Anghelacopoulos SE，Friess H，et al. The role of octreotideand somatostatin in acute and chronic pancreatitis. Digestion，1999，60(Suppl2):23 -31.

［5］刘丕，朱勇，徐龙，等. 加倍生长抑素联合早期肠内营养对重症急性胰腺炎炎症因子和肠通透性的影响［J］. 山东医药，2010，50(25):55.

［6］Ornberg RL. Proliferation and apoptosis measurement by color image analysis based on differential absorption［J］. Jhistochen cytochem，2001，49:1 059 -1 060.

［7］Yang LJ.Wang WL. Establishment of the hepatoma cells which express Bax protein stably and highly and observation of its apoptotic phenomema［J］. Di-si Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ). 2002，23(5):455 -458.