兰花组培快繁研究进展

李慧敏

摘 要：文章综述了兰花组织培养快繁技术的研究进展，着重阐述了不同外植体、培养因素对类原球茎诱导、增殖和分化的影响，扼要介绍了兰花快繁存在的问题，并对未来兰花的研究与开发进行了初步的探讨。

关键词：兰花 组培 快繁

兰花是整个兰科植物（orchidaceac）的总称，主要分布于热带、亚热带地区。我国以西南、东南地区居多。兰花花型奇特，花色高洁、花香素雅，有“花中君子”之称，可盆栽，也可作为切花，深受各国人民喜爱，具有很高的观赏价值和商业价值。自然条件下，兰科植物生长周期长，无性繁殖困难。传统的分株繁殖方式繁殖系数低，而有性繁殖也存在胚发育不完全，无子叶和胚乳，萌发时间长，萌发率极低等不足，难以大量繁殖和生产。随着人们对兰花需求量日益增大，传统繁殖已无法满足市场需求。通过组织培养建立无性繁殖体系进行繁殖，具有繁殖系数高，速度快、不受季节限制、可周年生产，短期内可获得大量实生苗等优点。本文旨在总结兰花组培快繁培养的研究进展。

1 外植体的选择

兰花组织培养根据所选外植体的不同可分为茎尖和侧芽培养、叶片培养、根尖培养、花器官培养等。

1.1 茎尖和侧芽

茎尖和侧芽顶端部分分生区的细胞具有分裂能力强，易诱导，遗传稳定等特性。对于远缘杂交所获得的品系，用此法可得到与母体遗传性状一致的植株。茎尖较适于复茎性兰花的快速繁殖，已经被有效用于大花蕙兰（Cymbidium）、卡特兰（Cattleya）、石斛兰（Dendrobium）、文心兰（Oncidium）、金线莲（Anoectochilus）、鹤顶兰（Phaius）、香子兰（Vanilla）、竹叶兰（Arundina）等兰花花芽和类原球茎（Protocorm like body，PLB）的诱导。这可能是由于茎尖及其周围组织较为幼嫩，容易脱分化并再分化成完整植株。但对一些单茎性兰花，如蝴蝶兰（Phalaeanopsis）、指甲兰（Aerides）等，摘取其茎尖就有可能损失母株，造成浪费 [1，2]，因此人们在实际应用中倾向于寻找其他可能的外植体。

1.2 叶片

与茎尖不同，叶片作为外植体，不需要母株做出牺牲，数量多，取材也不受季节如花期的限制。Wimber就率先从蕙兰的叶子中诱导得到PLB [1]。幼叶比老叶的诱导反应强，更容易诱导出体细胞胚，叶基部又比远轴端的叶尖强。万代兰（Vanda）幼嫩叶片整个表面都能诱导得到分生组织，而相对老的外植体，则局限于叶片基部；80 %的叶片基部都能够增殖。火焰兰（Renanthera imschootiana）在叶尖部位没有诱导反应时，叶基部仍能诱导出嫩芽，获得再生植株。而蓝色万代兰（V.coerulea）成熟植株的叶片并不能诱导得到嫩芽或者PLB [3，4]。这表明在同样的培养条件下，可以根据不同的诱导反应来判断外植体的来源和生理学年龄。切割方式和外植体大小均对PLB的诱导也有影响。横切比纵切效果好，6分片段的诱导率最高 [5]。

1.3 花梗和花梗芽

利用花梗或花梗芽进行快繁也是不必牺牲母株的一种方法。自Rotor利用蝴蝶兰离体花梗诱导得到蝴蝶兰组培苗后，这项技术被迅速广泛用于获得大量的蝴蝶兰种苗。目前蝴蝶兰的快繁方法中，许多都是利用花序基部的休眠芽进行快繁培养获得的。在诱导蝴蝶兰的PLB过程中，花梗芽的发育阶段、芽龄是影响诱导率的主要因素。成熟花梗诱导获得的再生芽较少；而幼嫩花梗能够更有效的诱导得到再生植株 [6]。除蝴蝶兰外，花梗培养已在万代兰，树兰，石斛兰，文心兰，苞舌兰等属中获得成功 [1]。

1.4 地下茎段

利用根状茎进行离体诱导得到小植株，具有简易可行的优点。根状茎可以通过种子诱导直接得到，也可以由假鳞茎上的侧芽诱导得到。对于许多陆生兰而言，尤其是对具有重要商业价值的兰花而言，这是一个非常有效的途径。通过根状茎诱导可以得到春兰、蕙兰、寒兰等的再生苗。对大部分寒兰的根状茎而言，BAP是最好的细胞分裂素；BAP的加入，能够减少分支，将分生组织转换为PLB，诱导根状茎顶部向上形成嫩芽，并长成植株 [7]。Chang等选取寒兰根状茎顶端1cm部位，置于含0.01～1 mg/lTDZ的培养基上，能够从根状茎茎尖诱导得到2～3个植株嫩芽 [8]。但Shimasaki等的研究表明，在常规的寒兰幼苗生产中，生长调节剂的应用并非必要 [9]。这可能是加入生长素后，会导致根状茎分生组织的细胞质区域减少，叶片形成受阻滞和引起分生组织派生物快速分离。

1.5 根段

对于多个兰花品种，通过根段进行植株再生的研究已有报道。利用气生根能够进行兰花繁殖，但形成植株的能力很低。美洲石斛的根系离体后在培养基中能长时间内保持成活，却无法形成芽或者PLB。有研究表明，蝴蝶兰能够通过根尖诱导得到愈伤组织，获得再生植株。飘唇兰根系在含NAA的培养基中能够诱导得到愈伤组织，加入椰奶、蛋白胨、维生素B后诱导率能达到54 %。由于飘唇兰根系自身的代谢特性，根系能够诱导得到大量的PLB；与幼嫩的根系相比，成熟的根系分生组织能够更简易快速的获得营养芽 [10]。与大部分其他兰花品种如文心兰、卡特兰相比，飘唇兰的这个过程具有增加有丝分裂活性的特性，对于涉及生化、生理学、植物细胞分化方面很有参考价值。

2 组培快繁影响因素

2.1 培养基

用于兰花组培的培养基种类繁多，目前最常用的培养基为MS、VW、KC、RM、White和它们的改良型，应用时可根据不同兰花品种和培养阶段采用不同配方的培养基。春兰和蕙兰根状茎在MS培养基上的诱导率最高，出现褐化情况也较少 [11，12]。摇动可能有助于消除培养基的极性，提高曝气，增加表面积，加速有毒代谢物的稀释，刺激PLB的形成。生物反应器的应用也加速了兰花的快繁。将20 g蝴蝶兰的叶片片段，置于生物反应器中（内含混合了木炭过滤物质的2l花宝培养基）浸入式培养8周，能够获得18000个左右的PLB [13]。金线莲的茎尖在含3l花宝培养基（包含着曝气装置，通气量0.006 vvm）的球形生物反应器中培养一段时间后，转移到0.75l花宝培养基（含2 g/L蛋白胨、0.5 g/L活性炭）中培养，能得到伸长并已生根的小植株 [14]。

2.2 植物激素

用于兰花组培的外源激素主要是生长素类和细胞分裂素类，根据不同的生长发育阶段配予所需激素的量和种类。生长素能够刺激根状茎的分支、鲜重；细胞分裂素能够有效刺激根状茎片段诱导植株再生。TDZ、2iP、玉米素等能促进蝴蝶兰叶片的体细胞胚胎发生，IAA、IBA，NAA，2，4-D却钝化体细胞的形成 [14]。用加入TDZ（0.3～3 mg/L）的1/2 MS培养基培养兰花，20 d后就能得到从嫩叶中诱导出的体细胞胚。经过TDZ处理，从5～7 cm长的叶片中获取的单个外植体，能够生成17～24个胚胎，而从2～4 cm长的叶片获取的外植体中能产生5～13个PLB [15，16]。Chang将TDZ用于植株再生，选取寒兰根状茎顶端1 cm部位，置于无TDZ和低TDZ的培养基中，只能获得根状茎，并不形成小植株；而在加入0.01～1 mg/L TDZ的培养基上，能够从根状茎茎尖诱导得到2～3个植株嫩芽 [8]。为了研究生长素诱导叶尖部位体细胞胚胎发生的效果，Chen等试验了IAA、2，4-D、TIBA、槲皮素和PCIB的效果，结果显示，除了TIBA，其他的生长调节剂都抑制体细胞胚的形成。嘧啶醇和多效唑能促进金蝶兰属植株叶片诱导体细胞胚形成，能提高诱导体细胞胚胎形成过程，GA3和矮壮素则有抑制作用。乙烯在较低浓度时明显抑制，在高浓度却能促进；乙烯还能够降低AgNO3和CoCl2产生的抑制作用 [17，18]。适宜浓度的AgNO3和CoCl2能提高原球茎的增殖系数 [19]。BAP对诱导兰花植株形成、将根状茎组织转换为PLB、直接形成多倍体植株都很有效 [9]。培养基中加入NAA和BAP使蕙兰和春兰根状茎芽诱导率更高，春兰根状茎的增殖倍数达到5.25 [11，12]。

2.3 天然提取物

天然提取物如蛋白胨、胡萝卜汁、番茄汁、牛肉膏、土豆匀浆、椰子汁、香蕉匀浆等已经被普遍用于兰花组培培养基的配制。在许多兰花品种的幼苗培养基中加入有机添加剂如椰子汁、香蕉匀浆、土豆匀浆对生长有促进作用。香蕉提取物富含自然细胞分裂素、生长素和赤霉素，能促进兰花的数量和幼苗根系的生长 [20]。在KC培养基中加入香蕉提取物能促进石斛单株的根系数量和长度。椰子汁包含多种营养和激素，经过高压灭菌后与兰花组培培养基的其他活性物质相容性高，能够刺激愈伤组织或者原球茎的形成，提高细小片段外植体的存活率，调整PLB分化过程 [10]。马生健等比较了不同浓度的椰乳、椰子汁、土豆匀浆和香蕉匀浆对蝴蝶兰PLB增殖的影响。结果表明，对蝴蝶兰PLB增殖效果总体影响由好至差依次为椰乳、椰子汁、土豆匀浆和香蕉匀浆 [21]。

3 存在问题和展望

在组培快繁过程中，仍存在一些问题，组培快繁技术体系仍需完善。受消毒过程困难、容易褐化、外植体渗出液有毒害和植物组织自身抵抗等因素的限制，兰花无菌快繁的污染难以控制，仍需要探索标准化的操作流程。兰花无菌苗的移栽成活率低。虽然通过反蒸发应用如加入ABA或是通过增加CO2浓度提高光合作用率减少蒸发率，或者通过改善培养基的组成如加入有机质（椰壳丝、刨花）提高基质效力，覆盖苔藓增加地表水分保留能力等措施获得较高的成活率，但从无菌环境到温室或者大田环境，大量的组培快繁苗无法存活，因此要实现幼苗从组培容器到自然环境的顺利过渡，提高存活率还需要不断探索。另外，高浓度的生长调节剂和长期继代培养会引起兰花离体培养变异，但确切的突变原因，仍待进一步研究 [22]。以组培快繁为基础，结合分子生物学，在开展兰花的综合育种、保存或工业化生产方面具有广阔的前景。

参考文献

[1] 李娟. 蝴蝶兰再生体系的建立及组织培养中的污染防治研究[D]. 陕西：西北师范大学，2009.

[2] 范成明，李枝林，何月秋. 兰花组织培养及分子生物学研究进展[J]. 园艺学报，2003，30（4）：487-491.

[3] Seeni S.，Latha P. G. Foliar regeneration of the endangered Red Vanda. Renanthera imschootiana Rolfe（Orchidaceae）[J]. Plant Cell Tissue Org. Cult，1992，29：167-172.

[4] Seeni S.，Latha P. G. In vitro multiplication and ecorehabilitation of the endangerd Blue Vanda[J]. Plant Cell Tissue Org. Cult，2000，61：1-8.

[5] 黄磊，陈之林，吴坤林，等. 切割方式和外植体大小对蝴蝶兰叶片诱导类原球茎的影响[J]. 热带亚热带植物学报，2009，17（3）：261-266.

[6] 张彦妮，边红琳，陈立新. 蝴蝶兰幼嫩花梗组织培养和快速繁殖[J]. 草业科学，2011（4）：590- 596.

[7] Paek K. Y.，Kozai T. Micropropagation of temperate Cymbidium via rhizome culture[J]. Hort Technology，1998，8：175-180.

[8] Chang C.，Chang W. C. Effect of thidiazuron on bud development of Cymbidium sinense Willd in vitro[J]. Plant Growth Regul， 2000，30：171-175.

[9] Shimasaki K.，Uemoto S. Micropropagation of a terrestrial Cymbidium species using rhizomes developed from seeds and pseudobulbs[J]. Plant Cell Tissue Org. Cult，1990，22：237-244.

[10] Samira Chugh，Satyakam Guha，I.Usha Rao. Micropropagation of orchids： A review on the potential of different explants[J]. Scientia Horticulturae，2009，122：507-520.

[11] 孙芳，李承秀，张林，等. 春兰名品杂交后代快繁与分化研究[J]. 中国农学通报，2012，28（10）：189-193.

[12] 于永畅，张林，王厚新. 影响蕙兰“大一品”根状茎芽分化的因素研究[J]. 农学学报，2012，2（12）：37-41.

[13] Park S. Y.，Murthy H. N.，Yoeup P.K.，et al. Mass multiplication of protocorm-like bodies using bioreactor system and subsequent plant regeneration in Phalaenopsis[J]. Plant Cell Tissue Org. Cult，2000，63：67-72.

[14] Wu R. Z.，Chakrabarty D.，Hahn E. J.，et al. Micropropagation of an endangered Jewel Orchid（Anoectochihus formosanus）using bioreactor system[J]. Hortic. Environ. Bio- technol，2007，48： 376-380.

[15] Chen J. T.，Chang W. C. Effects of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium‘Gower Ramsey[J]. Plant Growth Regul，2001，34， 229- 232.

[16] Chen J. T.，Chang C.，Chang W. C. Direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium‘Gower Ramseyand subsequent plant regeneration[J]. Plant Cell Rep.，1999， 19：143-149.

[17] Chang C.，Chang W. C. Effect of thidiazuron on bud development of Cymbidium sinense Willd in vitro[J]. Plant Growth Regul，2000，30：171-175.

[18] Chen J. T.，Chang W. C. Effects of GA3，ancymidol，cycocel and paclobutrazol on direct somatic embryogenesis of Oncidium in vitro[J]. Plant Cell Tissue Org. Cult，2003， 72（1）：105-108.

[19] 武爱龙.两种乙烯抑制剂对文心兰原球茎的培养效果[J].贵州农业科学，2010，38（6）：196- 198.

[20] Chen J. T.，Chang W. C.1-Aminocycloprop- ane-1-carboxylic acid enhanced direct somatic embryogenesis from Oncidium leaf cultures[J].Biol.Plant，2003，46：455-458.

[21] 马生健，陈玉青，廖婷，等. 蝴蝶兰原球茎的增殖研究与解剖学观察[J]. 中国农学通报，2011， 27（13）：139-143.

[22] Hsiao Y. Y.，Pan Z. J.，Hsu C. C.，et al. Research on Orchid Biology and Biotechnology[J]. Plant Cell Physiol，2011，52（9）：1467-1486.