生物钟基因period3的多态性及其与睡眠关系的研究进展

安怀杰，郑巍薇，史成和，吴成林，孙 涛*，赵晓航#

(海军总医院航海航空医学研究中心，北京 100048;* 通讯作者，E-mail:drsuntao1@163.com;#共同通讯作者，E-mail:xhztao@126.com)

睡眠为维持正常生理活动所必需。人类的睡眠活动受到一系列因素综合调节，包括外界因素和机体自身调节机制。外界因素包括光照、温度等;机体自身的调节则包括两个相对独立又互相联系的调节机制，即昼夜节律和睡眠平衡。本文主要是对昼夜节律生物钟核心环路基因per3的多态性及其与睡眠关系的研究进展。

1 昼夜节律与生物钟核心环路

昼夜节律，又称近日节律，是周期约为24 h的生理过程;即使在缺乏外界因素的条件下，如光照和温度等，昼夜节律仍能维持原有的生理周期［1］。从光合原核生物到高等真核生物，昼夜节律广泛存在。昼夜节律的标志是机体核心温度和血浆中皮质醇和褪黑素的水平。哺乳动物生物钟的调节中枢位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nuclei，SCN)，通过一系列的级联反应，使大脑与全身各个部位的节律趋于一致［2］。

在分子水平，昼夜节律是通过高度保守的转录水平反馈环路进行调控的，因此转录因子在昼夜节律调控方面发挥了重要的作用。昼夜节律的核心基因包括 clock、bmal1、npas2、per1－3 和 cry1－2。转录激活因子BMAL1与CLOCK都具有bHLH－PAS结构，二者能形成异二聚体结合在靶基因启动子区域的顺式元件E－box上，从而启动靶基因转录。二者的靶基因包括:period(在哺乳动物中，包括per1－3)和crytochrome(包括cry1和cry2)，以及占转录总量约8%－10%的“时钟控制基因”(clock－controlled genes，CCGs)。细胞质中的PER蛋白与CRY蛋白能形成异源复合体，并转位至细胞核中，与BMAL1－CLOCK蛋白复合体相互作用，进而抑制转录过程的进行;当PER－CRY蛋白复合体逐步降解后，BMAL1－CLOCK蛋白复合体逐步恢复转录活性，从而形成负反馈调节环路。在转录水平以外，这一环路同时还受到转录后水平的调节。一系列蛋白激酶以及蛋白酶体降解机制，包括E3连接酶和FBXL3，这些都能通过调节PERs/CRYs在mRNA和蛋白水平的稳定性，使PERs/CRYs的蛋白水平和细胞定位发生周期性变化，从而影响昼夜节律的周期。在负反馈调节环路和多种次级调节环路的综合作用下，昼夜节律的周期维持在约24 h［3］。

2 per3基因与昼夜节律

per家族基因是生物钟调节的核心基因。1971年，Konopka和Benzer首次报道在果蝇中发现调节节律的基因，命名为period基因［4］;而后在小鼠和人类中也发现了相似的基因。在哺乳动物中，per家族基因包括per1、per2和per3。利用基因敲除小鼠模型研究功能时发现，在per1、per2、cry1和cry2这四个基因中，仅存在任意一个基因即可以维持昼夜节律;与此相对，在per1/per2双敲除小鼠模型中，仅per3蛋白存在不足以维持昼夜节律。同时per3－/－小鼠的昼夜节律相关标志与野生型小鼠相比较并没有明显变化［5］。因此认为，per3并不是昼夜节律调节中的核心成分，其在昼夜节律形成中的作用机制并未明确。

随着对per3功能研究的深入，人们逐步了解其在昼夜节律中的作用。由于前期对生物节律的研究集中在依赖于视交叉上核的行为以及对光线的反应，尽管视交叉上核是控制哺乳动物自身节律的中枢，但其并非唯一具有自身节律的器官，肾上腺、肝脏、视网膜在体外均表现出自身节律［6－8］。Pendergast等利用per1－Luc的报告系统在体外检测不同器官的自身节律时发现，虽然在检测由视交叉上核控制的运动活力时per3－/－小鼠与野生小鼠没有显著差别;但是PER3蛋白失去功能时，小鼠的下丘脑和肺的自身节律出现变化，提示PER3可能参与其他器官自身节律的调节［9］。该课题组进一步利用per2－Luc报告基因系统，在体内进一步证实per3对视交叉上核、肾脏、胸腺、弓状体和脾等器官的自身节律没有显著影响，但在per3失活后，小鼠的垂体、肝、肾、食管和主动脉的自身周期缩短。提示per3对不同器官的节律存在不同的调节作用［8］。

3 per3对睡眠的影响

睡眠稳态平衡是调节睡眠的另一个重要因素。最初对睡眠平衡的研究来自于睡眠剥夺现象的观察:在睡眠剥夺后，机体需要的睡眠增加以进行补偿，从而形成一种平衡机制。睡眠平衡的标志是脑电图(electroencephalogram，EEG)的 Delta波活动(delta activity)或慢波睡眠活动，检测脑电图Delta波活动可以评估维持睡眠平衡的需要程度［10］。维持睡眠平衡的分子基础仍未明确。

Hasan等［11］报道，per3参与睡眠－清醒时间以及睡眠平衡的调节。利用per3基因敲除小鼠作为研究模型，发现在暗周期时对小鼠进行睡眠干扰，野生型小鼠的运动活力显著下降，而per3－/－小鼠运动活力的下降程度显著低于野生型小鼠，与npas2－/－小鼠的表型相类似。在以24 h为周期的基准水平上，per3－/－小鼠与野生型小鼠没有显著差别，但在暗周期中per3－/－小鼠的快速动眼期睡眠(rapid eye movement Sleep，REM)时间减少;在暗周期开始和结束时per3－/－小鼠表现出更高的EEG Delta波活动。睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)后，per3－/－小鼠表现出更高的非快速动眼期睡眠(non-rapid eye movement sleep，non-REM)的需求，EEG的Delta波活动升高;与此相对，在睡眠剥夺后的恢复期，代表REM的Theta波活动降低。这表明虽然per3不是昼夜节律调节的核心组分，但其通过参与清醒活力与睡眠平衡的调节，进一步对机体睡眠产生影响。

per3表达变化对人类睡眠的影响亦有报道。与年轻人相比较，大部分老年人的入睡和清醒时间更早，较难维持睡眠并且更容易受到环境的影响。Hida等［12］研究了老年人外周单核细胞中per1、per2和per3表达变化发现，与年轻人(8个不同群体人群，平均年龄21岁)的表达水平相比较，老年人(6个不同群体人群，平均年龄62岁)的外周单核细胞中per1和per2的表达没有显著变化;而per3的表达则出现变化:per3表达达到谷值的时间提前，而达到峰值的时间则延迟。同时研究结果显示，老年人褪黑素分泌周期略有提前，提示per3表达的变化可能与老年人下降的睡眠动力(homostatic sleep drive)有关。

4 per3基因多态性研究进展

人类的per3基因位于染色体1p36，基因长60 475 bp，mRNA长6 203 bp，共编码1201个氨基酸，共21个外显子。在第18个外显子区域存在4个或5个串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)，每个VNTR编码18个氨基酸。这一区域存在一系列预测的磷酸化位点，因此per3基因的VNTR多态性与人日常的昼行偏好、大脑皮质区活力以及认知水平等相关。根据per3等位基因VNTR的数目，人类存在per34/4(具有4个VNTR)，和per35/5(具有5个VNTR)两种纯合个体，以及per34/5的杂合个体。

不同人群中per3 VNTR分布频率不尽相同。Nadkarni等［13］统计了全球范围内不同人群的per34等位基因的分布频率，北非及西亚、南亚地区(阿尔及利亚、北苏丹、也门、印度)的频率最低，为0.5至0.6;东亚地区(蒙古、中国四川、日本)的频率最高，为0.8 至 0.9。Ciarleglio 等［14］选取全球范围内，非裔美国人、欧裔美国人、非洲加纳、中国汉族、巴布亚新几内亚五个不同人群的样本，分析clock、per2、per3等节律基因多态性的分布情况时发现，中国汉族样本中per34等位基因分布频率最高，为0.81，其余组样本分布频率介于0.41至0.66之间，提示中国人群per3 VNTR分布与其他族群有显著不同。安怀杰等［15］鉴定了汉族人群中，per34/4、per34/5、per35/5三种基因型分布频率分别为78.33%、20%和1.67%，表明汉族人大多数基因型为per34/4。

4.1 per3 VNTR多态性对睡眠生理及昼夜偏好的影响

前期研究表明，per3 VNTR影响个人昼夜偏好:per35/5健康个体有日行偏好，入睡等待时间较短;per34/4健康个体则有夜行偏好，入睡等待时间较长，与睡眠延迟综合征(delayed sleep phase syndrome，DSPS)相关［16］。在正常生理状态下与per34/4个体相比，per35/5个体具有更多的慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)与在非快眼动睡眠(non-REM)期间脑电图(EEG)的慢波睡眠活动(slow wave activity，SWA);在清醒状态和快眼动睡眠(REM)期间的Theta波和Alpha波活动也有增加［17］。

已有不同研究组报道per3 VNTR多态性与个人昼夜偏好的关系。睡眠情况会随着年龄增长有所改变，与年轻人相比，老年人清醒时间和次数延长、慢波睡眠时间较少，以及清醒时间提早。Viola等比较不同per3基因型老年人的睡眠差异时发现，per35/5纯合子褪黑素周期提前，并且更早到达褪黑素分泌顶点;同时夜间更易清醒，在快速动眼期睡眠时脑电波Delta活动增加，前Sigma活动降低［18］。这些结果表明老年人群的昼夜节律和睡眠平衡同时受到per3 VNTR多态性调节。Kunorozva等［19］则研究了非洲职业运动员中per3 VNTR和昼夜偏好的关系，发现在自行车和跑步两类运动员中，日行偏好的比例均高于普通人对照组，同时per35等位基因频率也更高，运动员的时间偏好与per3 VNTR多态性存在显著关联。有研究调查了432个挪威高校学生个体per3 VNTR数目与昼夜偏好的关系，但没有发现两者存在关联，提示昼夜偏好可能受到多种因素的综合影响［20］。

4.2 per3 VNTR多态性对失眠的影响

对不同基因型的健康志愿者进行睡眠剥夺实验后检测脑电图，在睡眠剥夺后清醒时期，per35/5个体Sigma和Alpha活动上升更为迅速，REM睡眠和觉醒时期Alpha活动显著增高。睡眠缺乏是现代社会普遍存在的现象，对睡眠平衡和认知能力的影响显著。在长期部分睡眠不足的情况下，per35/5个体呈现出更高的慢波睡眠活力、更高的睡眠平衡压力，因此有更高的睡眠需求;但在认知能力、执行能力和主观睡意方面则与per34/4个体没有显著区别［21］。另一项共19个志愿者参与的小样本研究中，研究者们通过评价心理警觉、客观警觉、主观睡意几个方面，发现per34/4个体在睡眠受限制(sleep restriction，SR)的情况下表现出更高的弹性;该研究结果提示per3可能在睡眠限制的情况下参与机体自身稳态的调节［22］。

相当一部分(36%－91%)酒精依赖者面临失眠的困扰，嗜酒者常表现出夜行偏好。因此Brower等［23］调查了酒精依赖者中失眠与per3 VNTR的关系。分别问卷调查了失眠程度、人格特点、精神状态、童年受虐情况、酒精成瘾情况，并分析per3 VNTR基因型，以研究per3 VNTR是否对酒精成瘾者的失眠情况存在影响。调查发现，在酒精依赖者中，饮酒多少、身体与精神的健康程度，均与失眠严重程度有关。值得注意的是，该调查发现，基因型为per34/4的酒精依赖者比per35/5依赖者具有更严重的失眠评分，提示在控制其他相关因素的前提下，per3 VNTR有助于预测酒精依赖者的失眠程度。

4.3 per3 SNP多态性与睡眠偏好

per3 VNTR多态性与睡眠的关系已被许多课题组证明。然而，基因多态性并不局限于VNTR多态性，还存在其他基因水平的可遗传变异，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是一种常见的可遗传变异，指在基因水平上发生单个核苷酸的变异引起的DNA序列的多态性。SNP可能导致基因翻译产物的成分、构象等发生改变，从而可能导致不同的生物学结果。SNP的分布具有特异性，不同人的SNP分布不尽相同。Gu等［24］通过对1 250个高加索人进行全基因组扫描，评价了约250万个SNP位点与人体晨间血液中褪黑素水平的关系，得到20个候选基因上1 298个候选SNP位点。他们发现，per3与血清中褪黑素水平存在显著关联;在最为显著的SNP位点(SNP1－7763877 G＞T)，血清褪黑素水平下降达到28%。Ojeda等［25］通过对209个大学生筛查基因组SNP，同时问卷调查其睡眠情况后统计发现，per3基因的一个非同义突变，rs2640909，与昼夜偏好有关。研究结合分析晨间复合尺度调查(composite scale of morningness，CSM)和SNP检测发现，rs2640909与CSM中的子量表“晨间活动”密切相关;第一次发现这一SNP与昼夜习性存在关联。

4.4 per3 VNTR对光照敏感性的影响

光对人类行为、警觉以及认知存在影响;除了可见光以外，不可见光对人的生理活动也存在调节作用。人类对不可见光的敏感程度与光的波长有关，对短波长的蓝光(460－480 nm)尤为敏感，如在生理周期的夜晚时期，蓝光(460 nm)能显著抑制褪黑素分泌从而影响睡眠。Vandewalle等研究发现，携带不同per3VNTR长度的人群对光的反应程度不同。蓝光照射能引起丘脑枕部位和大脑皮质前额、旁侧的反应增加，但不同等位基因型之间的反应时间不同:per35/5出现在睡眠缺乏时期，而per34/4出现在刚入睡时期;提示per3的VNTR多态性在对蓝光刺激的反应存在时相差异［26］。在另一项研究中，受试者经历1.5 h弱光，2 h完全黑暗，2 h蓝光照射，最后经历45 min的弱光恢复期，并检测受试者褪黑素水平等相关指标。Chellappa等［27］发现，在接收光强度为6 500 K的蓝光照射后，per35/5纯合子夜间褪黑素上升的水平显著下降，而per34/4纯合子则没有显著影响。同时，per35/5纯合子表现出更强的警觉性;脑电图Theta波活动程度是推测睡意程度的一个标志，清醒状态脑电图显示，per35/5纯合子Theta波活动与per34/4纯合子相比显著减弱。这一研究结果提示，per35/5纯合子对蓝光反应更为敏感。

5 展望

Per3作为昼夜节律基因中的一员，曾被认为不是昼夜节律的核心组分;但随着对per3研究的深入，它的功能逐步得到阐明，与睡眠之间的关系逐渐明确。关于per3的认识仍存在许多盲区，如per3在昼夜节律和睡眠平衡两个过程中的作用，是否扮演桥梁角色，它进行调节的分子机制又是如何，这些都需要进一步探索研究。

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