光照对辅助生殖实验室胚胎发育的负面影响

彭礼繁

PENG Li-fan

(四川省医学科学院·四川省人民医院辅助生殖医学中心，四川 成都610072)

光照有自然光照和人工光照两种。在通常情况下，辅助生殖(in-vitro fertilization，IVF)实验室的光照来自于人工光照，其光源是室内的照明灯及各式显微镜的光源。光照可对生物细胞造成损伤。直接的光照可通过直接的和间接的途径损伤生物细胞的DNA，蛋白质，脂质，导致细胞凋亡，基因突变，癌变或死亡［1］。光照对人类胚胎生长发育的影响，长久以来存有不同看法。光照一直是人类胚胎体外培养环境中最受争议的因素。

1 光照种类及相关影响因素

1.1 紫外线(UV) UV 极具细胞毒性，尤其是高能量的UV 照射。胚胎对UV 照射的损伤也极为敏感，UV 照射可造成胚胎发育减缓，停滞，细胞凋亡，基因突变，染色体异常，失去着床能力等多方面的有害效应。UV 对胚胎的损伤机理与其对生物细胞的损伤机理相同，既UV 可直接损伤DNA，也可通过多种途径诱发活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成。UV 射线对DNA 的攻击性极强。除了因为UV 的波长正好在DNA 吸收峰附近外，DNA 还不具备避免UV 损伤的保护机制，因为DNA 不具有几乎所有的生物组织都具有的UV 射线吸收因子(UVabsorbing agents)。因此DNA 成为生物细胞中最易受到UV 攻击的靶子［2］。UV 造成的DNA 损伤有两个特点:基因突变和具毒效性。前者来自于DNA 直接吸收UV 射线后产生的光产物;后者来自于UV激发的ROS 生成。

1.2 可见光 可见光能够对胚胎的正常生长发育产生不利的负面影响，已在众多的研究中得以证实［3～6］。具体表现是:暴露于可见光后，胚胎出现发育迟缓，甚至发育停滞，胚胎细胞出现凋亡、坏死。可见光负面影响的产生机理与可见光诱发的ROS含量升高有关，即可见光通过诱发细胞膜上的不饱和脂肪酸和类脂产生氧化反应，从而导致ROS 生成增加。含量升高的ROS 进而可导致DNA 受损，以及细胞内其他重要结构被破坏。

在体外培养过程中，胚胎暴露于可见光是胚胎细胞内ROS 含量明显增高的原因之一。有的作者认为［6］，既使是短暂的暴露也足以使ROS 的累积量达到可造成伤害的病理水平。有实验观察到［7］:可见光照射5 分钟之后，胚胎细胞内ROS 的累积量即达到造成伤害的病理水平。Ashok 等报道［7］，将胚胎暴露于光强度为14000 lux 的显微镜可见光中，H2O2的生成量随着光照时间的延长而增加，甚至每延长0．5 分钟都可导致H2O2生成量显著上升。

胚胎对不同波长的可见光的敏感度不同。不同波长的可见光对胚胎的损伤效应也不同。在可见光的波长范围内，波长为400 ～500 nm 的蓝光具有相对高的光照强度及组织穿透性，故对哺乳动物细胞伤害性较大。蓝光的有害作用主要来自于其激发胚胎细胞产生H2O2，以及来自于蓝光被呼吸链中的酶吸收后破坏细胞线粒体的能量代谢［8］。波长大于700 nm 的红外线可导致人类精子产生过量的ROS，从而导致精子死亡［9］。

1.3 太阳光 在各种光照中，对胚胎最具杀伤力的是太阳光的光照。将小鼠受精卵暴露于中午的阳光中仅1 ～60 秒钟，日后形成的囊胚中凋亡现象便明显增加。囊胚移植后，与对照组相比，实验组活产率的减少超过了60%［9］。

1.4 光照损伤与光照波长、强度和时间 光照对哺乳动物胚胎的损伤作用并不直接与光照强度和光照时间相关，而是与光照波长直接相关。紫外线(200～400 nm)，尤其是高能量的紫外线辐射对哺乳动物胚胎有着极强的毒性作用;可见光中的蓝光(400～500 nm)及接近蓝光的短波长光照对胚胎也有明显的损伤作用;而波长大于蓝光的其他可见光则负面作用明显减小［10］。在同等光照强度和同等光照时间情况下，冷光源照射与热光源照射对小鼠受精卵的损伤程度不同［11］，而冷热光源的差别仅在于冷光源中含有更多的短波长可见光(400 ～500 nm)。不同波长的光照所诱发的H2O2的产生量也不同，因而对胚胎发育的干扰程度也就不同［11］。仅就光照波长敏感度而言，生物细胞对于波长小于360 nm的UV 射线最为敏感，其次是蓝光(450 ～490 nm)，不太敏感的是绿光(大于500 nm)。哺乳动物胚胎对光照波长的敏感度也与一般生物细胞相类似。

在特定的光照波长下，光照对哺乳动物胚胎的损伤与光照强度和光照时间呈正比。即增强光照强度和延长光照时间均可使光照损伤加重。如将2-细胞的仓鼠胚胎暴露于波长为390 ～750 nm 的可见光下，随着光照强度增加(200、500、900 lux)，胚胎发育至桑椹胚，囊胚的比例依次减小。若将仓鼠胚胎暴露于光照强度为14000 lux 的显微镜可见光中，随着光照时间的延长，胚胎细胞内H2O2的生成量逐步增加，甚至每延长0．5 分钟光照都可看到H2O2生成量明显上升［11］。

1.5 光照损伤与胚胎培养环境 光照诱发胚胎细胞内ROS 生成增加的作用，受到胚胎培养环境因子的影响。这些影响因子包括:培养环境中O2的浓度和培养液中与抗氧化的有关成份。在相同的光照情况下，降低培养环境中O2的浓度，有助于减少ROS 的产生量。分析O2浓度与ROS 生成量的相关性可以看到［11］，在5% O2浓度的培养环境中，ROS的生成量最低;其次是20% O2浓度的培养环境;若当培养环境中的O2浓度达到40%时，ROS 生成量达到最大。另外，光照诱发的ROS 生成量也受到培养液中某些成分的影响。在培养液中加入L-半胱氨酸(L-Cysteine)，或将培养液中的酚红(Phenolred)去除均可显著地降低ROS 的生成，削弱光照对胚胎的损伤。

2 光照对胚胎生长发育的负面影响

在自然条件下，哺乳动物的卵子和胚胎生长发育在没有自然光照，也没有人工光照的母体环境内。因而哺乳动物的卵子和胚胎不具备有对抗光照的天然防御机制。然而在体外培养过程中，尤其是在ART 体外培养流程中，卵子和胚胎处于一个完全不同于其自然生长发育的环境条件内，他们被反复地暴露于各种波长，各种强度的光照之下，短者数十秒，长者数分钟。这些非生理性的光照对胚胎的体外生长发育起着极为不良的负面影响。

Girotti 等［12］关于光照能够破坏胚胎发育潜能的研究，大概是最早的有关光照对胚胎具有不良负面影响的报道之一。他们发现，来自普通照明光源中的可见光对仓鼠(hamster)卵子具有很大的伤害作用，而带有紫外射线的荧光灯比白炽光危害性更大。继Girotti 的报道之后，光照对胚胎的毒性作用在多种动物模型中得以证实。

早期胚胎对光照伤害极为敏感，尤其是高能量的照射。在有的物种中，光照对胚胎的损伤甚至大于温度下降所造成的胚胎损伤。Mauthe 等发现［13］，小鼠受精卵在受到波长为400 ～700 nm 的冷光源灯(实验室内一种常见的照明光源)照射15 分钟之后，虽然可以发育至囊胚，但形成的囊胚中调亡的细胞数量明显增加。将这些囊胚移植后，活产率仅为44%，与对照组的73%差别显著。而仓鼠受精卵在受到同样条件的光照之后，虽然97%的仓鼠受精卵仍可以完成第一次有丝分裂，但均不能继续向前发育，更没有囊胚形成。无论是小鼠受精卵，还是仓鼠受精卵，短暂1 ～60 秒的中午自然日光照射(光照强度大于20000 lux)就足以对它们造成灾难性的伤害。

虽然不同物种的胚胎对光照的敏感度不一样，甚至同一物种的胚胎在不同的发育阶段。对光照的敏感度也不完全一样，来源于动物模型的光照对胚胎损伤的数据未必能完全代表光照与人类胚胎的关系，但是光照对生物细胞普遍具有毒性作用的结论是确定的。Noda 等［14］对IVF 实验室内的各种光源进行了仔细的分析。他们测量和计算了常规IVF 流程中各项主要操作所用的平均暴光时间和平均光照强度。如在进行取卵、ICSI、移植等操作时，卵子和胚胎暴露于显微镜光照下的平均光照时间为多少，操作人员所用的平均光照强度为多少，并且使用滤光片后各项数值的变化为多少。根据这些测量数据和所用光源的波长，他们计算出胚胎在各种光照情况下受到的损伤程度。根据所得数据得出结论:在常规的IVF 操作过程中，若不使用滤光片，胚胎所受到的光照已足以对胚胎造成伤害。目前这种由可见光造成的胚胎损伤并没有引起各IVF 实验室的普遍注意。

3 光照对胚胎造成损伤的机理

光照对细胞具有毒性作用己在多种动物胚胎以及多种细胞株中得以证实［15］，包括人体乳腺癌细胞。虽然光照毒性作用的详细机理尚不完全清楚，但光照毒性的两个显著特点已在众多种类的细胞中被观察到［15］:一是光照后细胞内的DNA 被破坏，二是光照后细胞内的ROS 含量显著升高。因此有人推测［16］，除了因DNA 可吸收某种波长的射线而遭电磁波直接的破坏外，光照损伤机理可能与光照可通过多种途径诱发细胞内ROS 生成，导致ROS 浓度异常升高，细胞内发生氧化反应有关。ROS 是一类细胞有害物质，其特征为具有一个或几个不配对电子的分子、离子、原子或原子团。ROS 包括超氧化物(O2-)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(singlet oxygen，1O2)、羟自由基(HO·)以及各种脂质过氧化反应的产物。因含有未配对电子，ROS 的化学性质十分活泼。在正常生理情况下，细胞内ROS 的产生与被清除处于一种动态平衡之中，使ROS 的含量维持在一个正常的生理水平上。当ROS 产生过量，不能被抗氧化系统及时清除时，作为非特异性细胞毒素，高浓度的ROS 可广泛攻击细胞的核酸，脂类及蛋白质。致使DNA、蛋白质、脂质等生物分子受损，相关细胞信号转导和基因表达受影响，致使基因突变，线粒体受损，ATP 耗竭，细胞分裂阻滞，碎片增加，细胞凋亡，细胞退化及死亡。因此，光照对胚胎的损伤机理可能包括:①直接损伤DNA;②激发细胞内ROS(特别是H2O2)产生;③破坏线粒体呼吸链中的酶;④引发细胞凋亡。

4 IVF 实验室光照损伤的控制

光照，尤其是可见光的光照对配子，受精卵以及早期胚胎的负面影响在IVF 临床实践中尚没有引起足够的注意［16］。许多IVF 实验室在实际操作中并未将避免光照，减少光照置入认真考虑的范围内［17］。人们对光照损伤的防御措施通常仅停留在控制室内照明和减少胚胎在培养箱外的暴露时间上。实际上这是远远不够的。在制定预防光照损伤的措施时，有些基本要点需要加以明确。例如:紫外线是最具光照毒性的射线;可见光也不是安全的射线;在IVF 操作流程中，室内照明并不是造成胚胎光照损伤的主要光照来源。卵子，受精卵和胚胎的95%光照伤害来自于显微镜光源。IVF 实验室控制光照损伤的具体措施应该包括:①避免日光照射，实验室应以无窗为宜。②选择正确的照明光源，避免在实验室内使用任何带有紫外射线的光源，并控制实验室内各种光源的光照强度。③在显微镜上安装滤光片，将小于500nm 波长的光线滤除。这是消除UV 和蓝光的有效措施。④减少不必要的镜下观察及操作。⑤选用含有抗氧化因子的培养液。⑥采用低氧培养环境。由于光照可诱发基因突变，因此必需不断地对光照可能造成的试管婴儿近期和远期的安全性问题进行评估。

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