Nestin的结构及生物学活性研究

张 昊 王 勇

（大理学院 基础医学院，大理671000）

Nestin属于中间丝蛋白家族，是一种由胚胎期神经前体细胞一过性表达的Ⅵ型中间丝蛋白，目前作为神经前体细胞的特异性标记物。现就Nestin的结构及生物学活性的研究现状进行综述。

1 Nestin的发现及结构特点

1．1 发现

1985年，Hockfield与Mckay首先发现，在胚胎大鼠脊髓神经管神经前体细胞表达的一种蛋白，被nestin抗体特异性识别。因为抗体识别的细胞具有神经前体细胞的特征，所以nestin阳性细胞被认为是神经前体细胞［1］。1990 年 Lendahl［2］等克隆出编码nestin基因，在该基因编码的蛋白中发现，其中间段-α螺旋杆结构域的氨基酸序列与已知的其它所有5类中间丝蛋白有16%～29%的相似性，而被归为中间丝蛋白。通过基因氨基酸序列分析表明，它与其他几种中间丝蛋白有明显不同，将其单独归为第Ⅵ类中间丝蛋白，并将其命名为Nestin（巢蛋白）。

1．2 结构

1992年Dahlstrand［3］等最早分离了人类的巢蛋白基因，通过检测和比较发现，人和大鼠巢蛋白基因在羧基端重复区域和内含子的位置保守性较高，并且在3个内含子中的两个是与神经丝共享的，充分表明nestin在从其他中间丝分离出来之后和神经丝来自同一祖先的可能，而且也是神经丝分支中分离出的最早一员。

Nestin的结构与其他中间丝蛋白很相似，其氨基酸残基数为1821，蛋白质分子量为240，000。含有一个307个氨基酸的保守核心区，其中有一个α螺旋是由7个氨基酸特征序列构成的，残基a和d处于疏水；这个特征序列被认为具有促进丝形成时卷曲螺旋的相互作用，同时7个氨基酸特征序列由保守性不强的间隔序列分开［4］。作为第Ⅵ类中间丝蛋白，与其它5类中间丝蛋白的相比较，其基因的内含子位置，蛋白的N端（头，较短，只有11个氨基酸）、C端（尾，较长，有479个氨基酸，且含有许多电荷密度高的氨基酸重复序列）以及在组织细胞内的分布等方面均有区别。

2 Nestin的生物学活性

2．1 Nestin的表达

Nestin在细胞内位于细胞质，主要在未分化，具有分裂能力的细胞中表达，且具有严格的时空顺序，其表达与其它中间丝成员的表达有密切关系。例如，在CNS发育中，当神经胚形成时，Nestin开始在神经板皮层细胞表达，神经细胞迁移基本完成后，Nestin的表达量下降，vimentin开始表达，随后两者共存。一旦神经前体细胞朝终末方向分化成神经元和胶质细胞（如星形胶质细胞）时，Nestin就停止表达，被α-internexin、神经丝或外周蛋白代替［5］。这种表达模式在骨骼肌和心肌发育中得以进一步的证实。巢蛋白在骨骼肌母细胞和心肌细胞中最先高表达，出生后表达明显降低。随后是vimentin和结蛋白表达，三方共存于骨骼肌母细胞和心肌细胞［6］。可见，Nestin的表达有着严格的时空顺序，保证了神经前体细胞执行其内在的功能，与朝终末方向分化成相应的成熟细胞相匹配。

近年来实验发现在成年大鼠和成人基底前脑隔-斜角带复合体和海马可见许多nestinir神经元．这些nestin阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经元核蛋白（NeuN），但不与胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）共存，提示这些nestin阳性细胞为成熟的神经元，从而推论这是一类较恒定的神经元。双标染色结果显示，nestin-ir神经元与辅酶Ⅱ依赖性黄递酶神经元、胆碱能神经元、GABA能神经元相间分布，但不呈交叉反应，因此认为，nestin-ir神经元可能是MSDB中区别于胆碱能、GABA能神经元的新神经元，是与学习记忆有关的第3类神经元［7］。通过Nestin免疫荧光与EdU荧光双标观察及Nestin与DCX常规免疫组化实验显示基底前脑的nestin阳性神经元不表达DCX，从而证实不是新生的神经元，而是一种成熟的神经元［8］。通过单细胞RT-PCR、免疫荧光及电生理研究证实，基底前脑的nestin阳性细胞是胆碱能神经元的一种亚型［9，10］，而不是别于胆碱能神经元的新神经元。以上表明，基底前脑巢蛋白免疫反应阳性神经元是成熟胆碱能神经元的一种功能状态，而不是一种新生的神元。推测可能是Nestin让胆碱能神经元被赋予了特殊的功能，使神经元具备了更强的生理活性和可塑性。

2．2 Nestin表达的基因调控

Nestin转基因研究揭示，巢蛋白基因内有3个内含子，其中第1和第2内含子中分别有一个独立的细胞型特异调节因子，分别指导报告基因在发育中的肌肉细胞和神经前体细胞中表达。Nestin基因在第1个内含子内有两个E-盒模体（E-box motif），表现为螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix）结构，有调控骨骼肌母细胞表达巢蛋白的启动子和增强子。第2个内含子中决定巢蛋白在中枢神经系统表达的结构元件就存在于3′端保守区［11］。研究证实，Nestin基因的第2个内含子具有决定Nestin在中枢神经系统表达的两个增强子，分别为CNS增强子和区域特异性增强子［12］。在该增强子中，有一段长达30个碱基的结构域（Nes30），包含有核激素受体，转录因子SOX和转录因子POU的结合位点，发挥核心控件的特性［13］。在Nestin的第2个内含子中POU转录因子和位于POU转录因子结合位点上游的转录因子SOX的协同作用对增强子的激活起着关键性作用，这说明在Nes30中，这两个转录因子的协同作用在很大程度上反应了对巢蛋白神经增强子的调控。此外，Nestin的表达还受细胞周期蛋白素依赖性激酶（Cdk5）和甲状腺转录因子等内部因素调控，表明巢蛋白是上述因子在中枢神经系统发挥作用的一个重要的靶基因［14］。而外部因素，如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子家族、脑源性生长因子、神经生长因子、白细胞抑制因子、神经营养素3、血小板源性生长因子等也对Nestin表达进行调控。

2．3 Nestin的功能

目前Nestin的功能并不是十分清楚，近几年，由于基因工程技术的发展，研究者通过转基因以及基因敲除等手段研究Nestin的功能成为可能，并已取得了一些成果。

Nestin作为一种中间丝蛋白，可以和微管、微丝一起构成细胞骨架而达到维持神经前体细胞的正常形态，含有Nestin的细胞骨架有可能增加神经细胞的伸缩性和弹性，这对于发育过程是必要的。体外中间丝组装及转基因研究表明，由于Nestin不能独立、自行组装成中间丝，必须依赖与其共存的vimentin或α-internexin共聚组装成神经前体细胞内的中间丝，才能发挥细胞骨架的作用。

在胚胎期具有分裂能力的心肌细胞及骨骼肌母细胞所表达的巢蛋白，也可能以共聚的组装方式与波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）一道形成中间丝发挥相应的作用［15］。Nestin蛋白作为神经干细胞的标志，也是神经干细胞的自我更新所需［16］，因此Nestin可用于神经干细胞的分离、鉴别、培养，跟踪巢蛋白的表达来分析神经系统的发生过程。

3 展望

近年来研究证明，在胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等上皮肿瘤中也存在Nestin的表达［17］，大部分人认为检测Nestin在肿瘤组织中的表达水平对于评价肿瘤的生物学行为和患者的预后有明显帮助。这充分证明Nestin在肿瘤细胞及反应性星形胶质细胞中的表达，可被作为前体细胞的标志物或诊断低分化肿瘤的指标；也可作为神经系统病变和损伤的快速敏感诊断指标之一。医务工作者可以使用巢蛋白的荧光组化方法，通过检测巢蛋白的表达情况，从而确定病变发生的部位。因此临床上巢蛋白可作为疾病的诊断指标。

Nestin作为中间纤维蛋白的第4个亚族，被众多研究者当作是神经干细胞或祖细胞的标志物［18］，因此可用于分离神经干细胞，通过跟踪巢蛋白的表达来分析神经系统的发生过程。实验表明，神经干细胞移植到阿尔茨海默病（Alzheimer）模型大鼠脑内，不仅能够存活、增殖，并且可替代丢失、受损或坏死的神经细胞而重建神经通路，修复神经系统，从而改善学习记忆能力［19］。这表明，神经干细胞移植对治疗如阿尔茨海默病（老年性痴呆）、帕金森病、外伤性脊髓损伤等中枢神经神经系统疾病提供了一种有利的新手段，从而解决了胚胎脑组织移植治疗这些疾病中所遇到的众多技术和伦理道德难题［20］。因此，如何通过Nestin的研究，有效激活内源性神经干细胞，使其成为中枢神经系统疾病中有效治疗手段的研究成为当今的热点。随着对Nestin表达的调控机制的深入研究，Nestin在临床应用中越来越广泛，为神经系统疾病的治疗提供新思路。

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