酶法提取海狗肾多肽的工艺研究
2014-08-15董慧明
董慧明，才 凤，高 耸
0 引言
海狗肾(又名海狗鞭)(Testis et Penis Callorhini)是我国传统的名贵中药材，为海狮科动物海狗(Callorhinus ursinus Linnaeus)及海豹科动物多种海豹的雄性外生殖器[1]。早在《药性论》就有腽肭脐的记载，海狗肾之名，出自《本草图经》，历代本草均有发展，到了《本草纲目》已有6种之多[2]，主要用于补肾壮阳，益精补髓，治虚损痨伤，阳痿精衰，腰膝痿弱[1]。海狗肾中富含多肽及蛋白质，是其主要的活性成分。大量研究结果表明，蛋白质摄入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同时发现，多肽被吸收的速度比同组成的氨基酸要快[3]。大分子蛋白经酶水解后可形成大量低分子多肽，海狗肾由于其来源有限,比较珍贵，目前国内对海狗肾多肽的研究很少，本试验对酶解法制备海狗肾多肽工艺条件进行了研究，酶解法在较温和的条件下进行，得到的海狗肾多肽既利于人体吸收，同时又不破坏海狗肾中的天然营养成分，能够更好地保留海狗肾肽类及氨基酸成分的生物活性，为海狗肾的深度开发利用提供有效思路。
1 材料与方法
1.1 实验材料 海狗肾(干品)：为海豹雄性生殖器官，包括睾丸、附睾、精囊腺前列腺及阴茎，由加拿大进口，为合法捕杀。取膨化后的海狗肾干品(海豹鞭)，去其阴茎骨，切片干燥后粉碎，备用。
1.2 主要仪器与试剂 ①仪器：U-2010紫外可见分光光度计，日本岛津公司；pH计，上海虹益仪器仪表有限公司；电热恒温水浴锅，河南巩义市予华仪器有限公司；冷冻离心机，河南湘仪实验室仪器发展有限公司；冷冻干燥机，北京松源华兴科技有限公司；旋转蒸发仪，河南巩义市予华仪器有限公司；分析天平，德国赛多利斯仪器公司。②试剂：A.S1398精制中性蛋白酶(13万U/g)、碱性蛋白酶(10万U/g)，无锡酶制剂厂产，木瓜蛋白酶(80万U/g)、胰酶(4 000U/g)，广西南宁庞博生物科技有限公司；牛血清蛋白(BSA)，Folin-酚试剂，其他试剂均为分析纯。
1.3 工艺流程 海狗肾粉末→加水→加入蛋白酶水解→煮沸灭酶→低温静止l2 h→离心→上清液(海狗肾多肽混合物)→脱苦脱色→浓缩→冷冻干燥→海狗肾多肽粉末。
1.4 酶解单因素实验
1.4.1 水解酶的选择 酶法水解动物性蛋白的报道很多，综合文献研究和预试验[4-6]，采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶，在各酶最适反应条件下进行，并测定酶解液中多肽含量，进一步选取试验用酶。
1.4.2 酶解过程 取10 g海狗肾粉末，用选定的试验用酶进行酶解，以酶解液中多肽含量为指标，分别对海狗肾多肽提取工艺的酶解时间、加酶量、加水量、pH值、酶解温度5个因素进行优化。
1.5 正交方案设计 影响酶解反应的几个主要因素为加酶量、时间、pH、温度和加水量。根据以上单因素实验结果，并根据原料及选定蛋白酶的性质，酶解pH确定为7.0，选定加水量(A)、加酶量(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)4个因素，分别设置3个水平，进行正交试验L9(34)[7]。采用Folin-酚法测定酶解液海狗肾多肽含量并为指标优选酶解海狗肾多肽提取最佳工艺。其因素水平表见表1。
表1 海狗肾多肽提取工艺正交试验因素水平表
1.6 多肽含量的测定 采用Folin-酚法测定海狗肾水解液的多肽含量[8]。多肽得率(%)=多肽含量/海狗肾粉末质量×100%。
1.7 统计分析 采用SPSS 16.0统计软件对试验数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 单酶的选择 取10 g海狗肾粉末，加8倍体积的水，分别添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶各1.0%，在各酶最适pH值和温度下酶解5 h。由图1可见，用中性蛋白酶进行试验的酶解液中多肽含量最高，因此选择A.S1398精制中性蛋白酶作为试验用酶。
2.2 不同因素对酶解反应的影响
2.2.1 加酶量对多肽含量的影响 在酶解温度为50 ℃、加水量8倍、pH 7.0的条件下进行酶解试验，分别加入中性蛋白酶0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%，酶解5 h，检测不同加酶量下的多肽含量。由图2可知，随着加酶量的增加多肽含量递增，在加酶量为1.5%后曲线趋于平稳，说明在此之后增加加酶量对多肽含量无太大影响，因此正交试验重点考察0.5%～1.5%的加酶量对多肽含量的影响。 图2为加酶量对多肽含量的影响。
图1 不同蛋白酶酶解多肽含量的比较
图2 加酶量对肽含量的影响
2.2.2 加水量对多肽含量的影响 在酶解温度为50 ℃、加酶量1.0%、pH 7.0的条件下进行酶解试验，分别加入中性蛋白酶，在加水量为4、6、8、10、12倍下酶解5 h，检测不同加水量下的多肽含量。由图3可知，加水量增加时，水解度下降，其中加水量8倍时，多肽含量最高。可能是加水量增加后，酶浓度被稀释，反而降低了多肽含量。在酶解过程中，加水量过少，反应体系过于粘稠，会导致酶解反应不充分，而加水量过多，则会增加后续处理的成本。因此正交试验选取加水量为5、7、9倍条件下进行。
2.2.3 底物溶液pH对多肽含量的影响 在酶解温度为50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%的条件下进行酶解试验，分别加入中性蛋白酶，在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下酶解5 h，检测不同pH下的多肽含量。由图4可知，中性蛋白酶在pH 7.0的条件下酶解效果最好，酶解液中的多肽含量最高，而且反应体系本身成中性，不用过多调节pH值，故正交试验选定在pH 7.0条件下进行。
图3 加水量对多肽含量的影响
图4 pH对多肽含量的影响
2.2.4 酶解温度对多肽含量的影响 在加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的条件下进行酶解试验，分别加入中性蛋白酶，在温度为40、45、50、55、65 ℃下酶解5 h，检测不同温度下的多肽含量。由图5可知，多肽含量随着温度的增加呈递增趋势，在50 ℃时水解度最高，再增加温度则多肽含量开始下降。试验表明，中性蛋白酶的最佳酶解温度在45～55 ℃之间。
图5 酶解温度对多肽含量的影响
2.2.5 酶解时间对多肽含量的影响 在酶解温度为50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的条件下进行酶解试验，分别加入中性蛋白酶，考察时间为1、2、4、6、8 h下的酶解效果，检测不同酶解时间下的多肽含量。由图6可知，多肽含量随着酶解时间的增加呈递增趋势，在酶解4 h时多肽含量曲线趋于平稳，说明在此之后延长水解时间对酶解液中多肽含量无太大影响，因此选择3、4、5 h三个酶解时间进行正交试验优化。
图6 酶解时间对多肽含量的影响
2.3 正交试验优化 试验结果见表2。由表2可见，四个因素的极差大小顺序为A>B>D>C，即加水量>加酶量>酶解时间>酶解温度，各因素与水平的组合应为A3B3D2C2。进一步进行方差分析，结果见表3。
表2 正交试验表及结果
表3 方差分析表
查表得F0.05(2.2)=19.00，F0.0l(2.2)=99.00，经方差分析，发现A因素极具显著性，B因素有显著意义，D因素接近显著值，C因素无显著意义，表明本试验设计较有意义。结合R水平，得出海狗肾多肽提取最佳工艺条件：加水量为9倍量，加酶量1.5%，酶解温度50 ℃，反应时间4 h。即最佳提取工艺为A3B3D2C2。
2.4 最佳工艺确定 精密称取海狗肾粉末10 g，按上述最佳提取工艺A3B3D2C2提取3次，测定并计算海狗肾多肽的含量和多肽得率。结果见表4。
表4 验证试验表
通过正交验证试验可知，验证试验海狗肾多肽的含量均高于正交试验结果。
3 结论
本试验采用酶解法提取海狗肾多肽，并以海狗肾多肽含量为考察工艺的指标，通过单因素试验研究了加酶量、温度、加水量、pH值和时间等因素对多肽含量的影响，并采用L9(34)正交试验表进行实验，得出的优化组合为A3B3D2C2，从而最终确定了用A.S1398中性蛋白酶提取海狗肾多肽的工艺条件为：加水9倍量，加酶量1.5%，酶解温度50 ℃，酶解时间4 h，pH 7.0。在此条件下提取海狗肾多肽，多肽得率可达到48.41%。
目前以海狗肾为原料的保健药品剂型多为胶囊，如果制成胶囊服用则必须粉碎成粉末，而用常规的动物药粉碎方法对本品来说很困难，不易成粉[9]。本试验用酶解法提取海狗肾多肽得到多肽溶液，后冷冻干燥得到多肽粉末，该多肽粉末不仅颗粒微小，易于保存，而且除含有低分子多肽外，还含有大量的氨基酸、微量元素等活性成分，可直接开发成胶囊、软胶囊、口含片及口服液等剂型的保健药品，本试验得到的酶法提取海狗肾多肽工艺可操作性强，适合规模化生产。
参考文献：
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