X连锁凋亡抑制蛋白通路在白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的人白血病细胞HL-60凋亡中的作用

阚 亮,李铁军,何 平*

0 引言

白花蛇舌草分布在日本以及中国大陆的南方等地，是茜草科耳草属的植物，生长于海拔1 800米的地区，多生长于山地岩石上。其中成药味苦、淡，性寒。常用于热症、肠胃痛、肿瘤、泌尿系疾病、虫蛇咬伤等疾病的治疗[1-3]。最近研究表明，白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌对多种肿瘤细胞具有明显增殖抑制及诱导凋亡作用[4-6]。但是，目前关于白花蛇舌草抗肿瘤的机制，特别是2-羟基-3-甲基蒽醌对体外培养的白血病细胞没有进行更深入的研究，不能从根本上对本药的抗白血病作用及其机制进行解释。本实验主要探讨X连锁凋亡抑制蛋白通路在白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的白血病细胞HL-60凋亡过程中的表达，明确其诱导白血病细胞凋亡的分子机制，为开发新型抗白血病药物及其临床应用奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 细胞培养试剂购自美国Invitrogen公司;Embelin及其他所有试剂均购自美国Sigma公司；离心机购自德国Eppendorf 公司;流式细胞仪购自美国Backman公司。2-Hydroxy-3-methylanthraquinone购自Hean生物技术公司(上海，中国)，Shi等[7]已经证明了2-Hydroxy-3-methylanthraquinone的化学结构。

1.2 HL-60细胞培养 急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60购自中科院细胞所。细胞培养于含10%小牛血清(杭州四季青生物有限公司)的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 2-羟基-3-甲基蒽醌作用于HL-60细胞 当2-羟基-3-甲基蒽醌的浓度为50 μm时，分别培养0、24、48及72 h。

1.4 Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学改变 HL-60细胞以50 μm 2-羟基-3-甲基蒽醌处理0、24、48及72 h后，4%多聚甲醛固定20 min，1 mg/mL的Hoechst 33258避光染色10 min 后封片避光，荧光显微镜下观察后照相并计数500个细胞核，计算凋亡百分率。

1.5 Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡 HL-60细胞的凋亡率用流式细胞仪检测。106细胞加入含有Annexin V 的60 μL 结合缓冲液4℃避光15 min。为了区别早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞，细胞在检测前同时染Annexin V 和PI。细胞结合Annexin V FITC 和PI 后，其结果采用CellQuest软件用流式细胞仪进行分析(FACS Calibur，BD Biosciences)。每个样品至少计数10 000个细胞。

1.6 Western blot检测Survivin、Smac、XIAP、cXIAP1/2等蛋白的表达 HL-60细胞经处理一定时间后，用PBS 洗涤3次，沉淀物在冰上用裂解液重悬20 min。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过电转仪将蛋白转移至PVDF 膜，转膜时间为 2 h。2%脱脂奶粉室温封闭1 h,2%脱脂奶粉稀释一抗，4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜 2 次，0.5×封闭液洗膜 2 次，每次15 min；1%脱脂奶粉稀释二抗(1∶6 000)，室温孵育1 h；TBST 洗膜4 次，每次15 min，TBS 洗 2 次，每次15 min。用抗β-actin 抗体标记。所有测量结果用抗β-actin 蛋白标志标准化。按PIERCE 化学发光试剂盒说明，用发光试剂浸润PVDF 膜，X 线胶片在感光屏内曝光成像，结果在凝胶成像仪上照相。同一实验重复3次。

2 结果

2.1 Hoechst 33258荧光染色 Hoechst 33258将细胞核染为紫蓝色，正常细胞核呈均匀弥散荧光，凋亡细胞核呈颗粒状荧光或浓染块状。对照组的HL-60细胞多数呈均匀弥散荧光，经50 μm 2-羟基-3-甲基蒽醌处理48 h后，细胞核浓染边集及碎裂比例较多(见图1)。

2.2 流式细胞仪分析急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60的凋亡情况 50 μm 2-羟基-3-甲基蒽醌作用于人白血病细胞株HL-60后发生凋亡，并且早期凋亡率及总凋亡率均随着2-羟基-3-甲基蒽醌作用时间的延长而升高。作用24、48及72 h后，早期凋亡率和总凋亡率与0 h比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.001)，结果见图2。

2.3 2-羟基-3-甲基蒽醌对Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac等表达的影响 2-羟基-3-甲基蒽醌作用不同时间后，免疫印迹法检测Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac的表达。结果显示，随着作用时间的延长，XIAP和cIAP1/2的表达逐渐下降，Smac的表达逐渐增加，而Survivin的表达不变，结果见图3。

图1 Hoechst 33258 荧光染色检测人白血病细胞株HL-60细胞凋亡

图2 Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测人白血病细胞株HL-60细胞的凋亡情况

图3 2-羟基-3-甲基蒽醌对Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac等表达的影响

3 讨论

凋亡 抑 制 蛋 白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族，能够对抗各种凋亡诱导因素，抵抗细胞凋亡，与肿瘤的关系十分密切[8-10]。第二个线粒体衍生的半胱天冬酶激活蛋白(Second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)是一种线粒体膜间隙蛋白，通过去除IAPs对半胱氨酸蛋白酶Caspase的抑制作用，从而促进细胞的凋亡[11-12]。

随着对中医药抗肿瘤作用研究的不断深入，中药在白血病临床治疗中的效果越来越受到关注[13-14]。现已有不少学者将白花蛇舌草及其有效成分用于抗白血病作用的研究，并取得了一定的进展。白花蛇舌草及其有效成分药理作用广泛，可以抑制肿瘤细胞增殖，阻止细胞周期进展并诱导细胞凋亡。研究证明，白花蛇舌草醇提物及其化学成分2-羟基-3-甲基蒽醌能够以时间和剂量依赖的方式诱导人白血病细胞株U937和 THP-1 细胞凋亡，并且U937和 THP-1细胞凋亡的机制涉及磷酸化Akt表达下调；Caspase-3和Caspase-9的活性随着感染时间的延长而增加，而加入PI3K的抑制剂可使其活性和U937 细胞的凋亡率增加；加入Caspase-3和Caspase-9的抑制剂可抑制其活性和U937细胞的凋亡率，说明PI3K信号转导通路和Caspase-3和Caspase-9在白花蛇舌草醇提物及2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的U937和 THP-1细胞凋亡过程中起重要作用[15]。研究表明，白花蛇舌草醇提取物及水提取物能够抑制人类红白血病细胞(K562细胞)的生长并且诱导其凋亡[16-17]。本课题组在国内率先发现，白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌通过Fas/FasL和Caspase-8通路诱导人白血病THP-1细胞的凋亡[18]。

在本研究中，笔者应用2-羟基-3-甲基蒽醌所致的凋亡人白血病细胞HL-60作为研究模型，探讨Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac在此过程中的作用。结果显示，随着作用时间的延长，HL-60细胞凋亡率逐渐增加，XIAP和cIAP1/2蛋白的表达逐渐下降,而Smac蛋白的表达逐渐增加。

总之，本研究结果表明，Smac、XIAP和cIAP1/2在白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的人白血病细胞凋亡过程中起着重要作用，进一步提示了2-羟基-3-甲基蒽醌诱导白血病细胞凋亡是其抗白血病作用的机制之一，同时也为临床应用2-羟基-3-甲基蒽醌治疗白血病提供了实验基础。

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