蛋白质组学核心技术研究综述

张凤

（莱芜职业技术学院，山东 莱芜271100）

2003年4月14日，人类基因组测序完成，生命科学研究的重心转移到蛋白质组（基因组的表达产物）上来，这标志着后基因组时代的到来。因为蛋白质是生命现象复杂性和多变性的直接体现者，是基因功能活动的执行者，利用蛋白质组的研究有望找到“孤儿”基因的生物功能线索，进而揭示它在整个功能网络的地位，从而了解生命现象和生命本质。因此，蛋白质组学将会在揭示生命奥秘过程中起到极其重要的作用[1]837[2]1973。

一、蛋白质组学

澳大利亚的MarcWilkins等人在1994年首先提出一个与基因组相对应的整体的概念-蛋白质组，它指的是一种基因组转录、翻译及翻译后修饰的全套蛋白质[3]20。

蛋白质组学(proteomics)是研究细胞内基因组表达的全部蛋白质在特定时空下的动态变化，分析细胞内的蛋白质组成、表达模式以及各组分之间的关系，理解蛋白质的结构与功能的统一，进而调控生物体的生命活动，揭示生命现象的本质[4]648[5]1152。

二、蛋白质组学核心技术

双向凝胶电泳技术(2-DE)、质谱技术（MS）和生物信息学是蛋白质组学研究的三大核心实验技术。

1、2-DE

1975年，意大利化学家O’Farrel在研究大肠杆、几尼猪和鼠的蛋白质时发明了双向电泳技术（ISO-DLAT）[6]4008。目前，2-DE是进行蛋白质分离的最关键、最成熟、最常用的技术。其原理是：根据蛋白质等电点（pI）不同，在pH梯度胶上进行等电聚焦(IEF)的第一向分离；根据分子量大小，在SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)中进行第二向分离。

蛋白质分离后可通过不同的方法染色显示，传统的考马斯亮蓝染色法易操作，重复性好，但灵敏度低。银染法可提高两个数量级，但显色的浅性范围较窄、重复性差。Berggren[7]2509等人研究发现荧光染色灵敏度与银染相似，但速度更快、线性范围更宽，同时减少了对质谱鉴定的影响。

2-DE可在二维水平上分离10-150KD分子量的蛋白质，是目前唯一能溶解大量蛋白质并能进行定量的一种方法，操作简便，分辨率、灵敏度高，重复性较好，可用计算机进行分离后图像的分析处理，能提供不同基因表达与调控的特点。Agrawal等用2-DE等法，首次对臭氧对水稻幼苗蛋白的影响进行了检测[8]947-959。王经源等定量比较了汕优63及其双亲苗期的第三叶蛋白质组，得到1667个以上的蛋白质点，在3个品系间发现23个显著差异的蛋白质点[9]33-53。但2-DE也有其局限性：低拷贝数(<1000)、疏水性（如膜蛋白）、高分子量(>200kD)和低分子量(<8kD)蛋白无法检测；极酸和极碱性蛋白(pH<3或pH>10)易在电泳中发生漂移；对试剂质量要求高；样品复杂程度高时，灵敏度和分辨率较低；自动化程度低[10]3670[11]247。Unlu等[12]2071-2077对2-DE进行了改进，提出了差异凝胶电泳(DIGE)。蛋白质分离前，将荧光素标记后的多种蛋白样品等量混合，在同一块凝胶内电泳，分离后进行质谱分析。此法可对蛋白质的表达进行精确、可重复的定量分析，用此法也可分析正常组织和病理（癌变或植物受外界胁迫等）条件下蛋白质表达的差异。与常规的2-DE相比，工作量小，操作更简便，效率、灵敏度更高，差异分析更准确，结果更可信。

近年来，随着色谱技术的发展，液相色谱法(Liquid Chromatography，LC)成为非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。为弥补单一液相分离的不足，现在一般优化组合两种或两种以上不同原理的液相色谱，常见的有二维液相色谱（2D-LC）、二维毛细管电泳（2D-CE）等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。Nielsen等应用LC—MS—MS技术成功分离和鉴定了海马组织中的1685种蛋白质[13]405。目前一种最新的色谱分离技术-毛细管电泳(CE)被广泛应用于蛋白质的高效分离分析。CE分析样品量少、成本低、速度快、灵敏度高、分离范围大，2-DE无法分离的可用CE实现，并自动在线分析，但对于复杂样品的分离尚不完全[14]89。

2、质谱技术（MS）

MS是鉴定2-DE分离后的蛋白质的基本手段，是蛋白质组学研究的支撑技术之一，是最为重要的蛋白质组学研究的技术突破[15]841。其基本原理是：样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m／z)的差异来分离并确定其Mr[16]636。目前最常用的有两种：电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDIMS)。前者是喷射过程中，液相样品分子在强电场的作用下，高电压将其离子化后进入质量分析器，根据m／z差异进行分离，确定其分子质量。目前此技术已应用到很多串联质谱中，如四级杆一飞行时间(Q-TOF)质谱、离子肼（ion-trap）质谱等，灵敏度达fmol(10-15)。后者是让激光照射离子化的样品在加速电场中飞行，检测不同的离子飞行时间（TOF）来确请定m／z（TOF和m／z的平方根成正比），得到一系列酶解肽段的分子量或部分肽序列，然后检索相应的数据库来快速鉴定蛋白质[14]89。目前，在鉴定蛋白质谱中应用最广泛的是在MALDIMS基础上改进的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，此技术可提高鉴定的准确性和特异性，但对低分子量蛋白质的鉴定效果不好[17]15。后来在此基础上又进行了改进，形成了表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS），此法可直接检测粗提样品，且用量少（最少0.5-5ul），灵敏度高，能检测出低丰度、小分子量的蛋白质，可快速检测多个标记物，可测定膜蛋白等疏水蛋白。

这两种技术均能在fmol(10-15)的水平上准确分析高达几十万Mr的生物大分子，具有高通量、高灵敏度和高质量的检测范围等特点[18]1479。但MS也有其自身的局限，如仪器较昂贵，不能区别氨基酸的同分异构体如Leu和Ile、Lys和Gln，无法对某些多肽的固有序列进行测定，不能将带电电荷和分子量相同的同分异构体进行区分。在应用中，MALDI—MS常和2D凝胶电泳联用，ESI-MS常和LC联用[19]1519-1520。如卢定强等利用LC-ESI-MS法对银杏叶进行了初步研究，得到了ESI-MS质谱图，分析鉴别出白果内酯及银杏内酯A、B、C、J[20]9211。

3、生物信息学

它是伴随着人类基因组计划的启动和信息科学的迅猛发展而兴起的、以生物、数学、计算机等多学科为理论基础形成的一门新的交叉性学科。研究蛋白质、核酸等生物大分子，运用数学、计算机科学手段收集、存储、加工、分析并解释大量原始生物试验数据，获得具有生物学意义的生物信息，通过查询、搜索、比较、分析相关生物信息，获取基因编码、调控、蛋白质和核酸结构功能及相互关系等信息，寻找蛋白质家族保守序列，预测蛋白质高级结构，是蛋白质组学研究的重要支撑技术[21]6142，它的发展将给生命科学的研究带来重大变革。

目前，在蛋白质组学研究方面的应用主要有：构建与分析2-DE图谱。建立和搜索相关数据库（SMSS-PROT、BLOCKS、SMART等），其中日内瓦大学建立的EXPASY服务器是最著名的蛋白质数据库，SWISS-PROT是目前世界最大、种类最多的蛋白质组数据库。预测蛋白质结构，开发与应用各种分析及检索软件，通过网络检索功能蛋白质组学2-DE图谱对应的蛋白质数据库，来识别蛋白质、描述其理化性质、预测可能的翻译后调节方式及三维结构与功能等，这些都极大地提高了蛋白质组学的研究效率[14]90[22]591。

三、展望

近年来，随着蛋白质组学三大核心实验技术的不断发展，蛋白质组学在揭示生长、发育和代谢调控等生命活动的规律研究中取得了重大的突破，已广泛应用在医学和生命科学基础研究中。医学上，可比较正常与疾病细胞中的蛋白质电泳图谱，分离鉴定其各自的蛋白质，发现疾病相关蛋白—分子标记物，从而进行疾病的诊断。也可以对致病菌的蛋白质组进行分析研究，验证已有的药物靶点，阐明药物作用机理，发现新的作用位点和受体，为药物开发奠定基础。在生物基础研究上也涉及多种生物学现象，如信号转导、蛋白质折叠、细胞分化等。我们相信，随着新的研究技术的不断突破，分离鉴定的低丰度蛋白及新蛋白会越来越多，更多的生物学现象将会被揭示，更多的疾病相关蛋白将会被分离鉴定出来，蛋白质组学必将逐渐揭示生命的奥秘，推动人类的健康事业，给人类生活带来重大影响。

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