Toll 样受体9与自身免疫性糖尿病

郑金珏 陈梦蝶 综述 郑超 审校

1 Toll样受体概况

Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)属1型跨膜蛋白，是哺乳动物主要的天然模式识别受体, 参与病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的识别，引发信号转导，启动多种与炎症反应相关的基因转录，导致炎症介质的释放，并最终激活获得性免疫系统。Toll样受体在不同种生物体内保持高度的同源性，目前已证实在哺乳动物体内存在的TLRs有TLR1-TLR13共13种[2，11]。目前已经有7种TLR被鉴定出其相应配体[3,12]，如TLR1，2，6可以协作识别细菌细胞壁的肽聚糖（PGN）和细菌脂蛋白（BLP），TLR3可以特异性识别病毒分子中的dsRNA，革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖（LPS）是TLR4的激动剂，TLR5识别细菌鞭毛蛋白，TLR7和TLR8可以特异性识别ssRNA[4]，TLR9主要参与并激活由病原体CpG基序刺激后细胞信号通路,引起大量炎性因子的产生[5,7]。

2 TLR9的生物学特性

2.1 TLR9的结构与分布

人类TLR9基因位于第3号染色体（3p2113）,有2个外显子组成，全长约5kb。TLR9基因与MyD88基因相连，以单外显(monoexonic)或者双外显(biexonic)等两种最常见的拼接方式表达[8,12]。TLR9蛋白由1032个氨基酸编码，其分子结构与TLR家族其他成员一样，都是由胞膜外区、跨膜区、胞浆区组成。小鼠的胞外区LRR有16个，而人有18个[9]。TLR9蛋白在脾脏中表达量最高，其次是卵巢、外周血白细胞，胸腺、肺、肠、前列腺、脑和胰腺。在各种免疫细胞中TLR9的表达量也有很大差异，尤其是记忆性B淋巴细胞和胞浆样树突状细胞(DC)表达最为丰富[10]。

2.2 TLR9的配体

研究证实，TLR9的天然激动剂是CpG。CpG是存在于细菌或病毒基因组中出现频率较高的非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosine phosphate—guanosine，CpG)序列，这些短核苷酸序列具有免疫活性。将含有CpG基序的细菌或病毒DNA称CpG DNA，人工合成的含有CpG基序的寡核苷酸(oligodeexynucleotide，ODN)序列称CpG ODN。Melinda A[11,14]等通过体外实验发现，用CpG寡核苷酸序列刺激TLR9+的乳腺癌细胞MDA-MB-231和T47-D，可以降低血清基质金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的表达，而在TLR9-的乳腺癌细胞MCF-7中无此现象。Labzhinov PA等[3]研究发现，敲除了TLR2，TLR4基因的小鼠，对CpG DNA仍具有反应性，比如脾脏淋巴细胞的增殖，巨噬细胞分泌炎症细胞因子以及树突状细胞的成熟加快等。而敲除TLR9基因的小鼠(TLR9-/-)则无以上反应。这些研究结果都说明TLR9通路的激活与CpG DNA有紧密联系。

2.3 TLR9对CpG DNA/ODN的摄取

无论是来自细菌或者病毒的CpG DNA还是人工合成的CpG DNA都可通过细胞的非序列依赖性胞吞作用摄入细胞体内，形成内体。Vollmer J等[14]发现，包含CpG DNA/ODN的内体在P13激酶、Rab5以及GTP结合蛋白的调控下，不断成熟，酸化，进而激活TLR9介导的信号途径。但是CpG骨架的结构影响细胞对其摄取，有实验证实CpG ODN经过硫代磷酸化修饰后更容易被细胞摄取，而且增强了原有序列的免疫刺激活性，而甲基化修饰却无此作用[13]。

2.4 TLR9-MyD88信号转导机制

CpG-ODN与细胞表面接触后，通过胞吞作用进入细胞内形成内体形式，随着内体的成熟、酸化，TLR9被招募并识别CpG-ODN，两者结合形成二聚体[14，15]。髓样细胞分化因子88（MyD88）包含两个结构域，TIR结构域位于C末端，N末端有个“死亡”结构域，与白介素-1受体相关激酶（IRAK）的死亡结构域高度同源，在受刺激后可被招募。因此结合了CpG-ODN的TLR9招募MyD88分子与之结合，形成MyD88-TLR复合物。该复合物与白介素-1相关蛋白激酶（IRAK）4结合并激活IRAK 4后，反过来作用于IRAK 1，使之高度磷酸化。IRAK 1高度磷酸化后从之前的复合物上解离下来，与转接蛋白TNF受体相关因子6（TRAF6）相互作用形成复合体[15,16]。TRAF6介导的途径有好多条，其中一条通过激活转化生长因子β（TGFβ）激活激酶1(TGF-activated kinase 1,TAK1)，活化的TAK1顺序激活IKK,IKK的激活使IκB磷酸化从NF-κB上脱落并被泛素化，使得NF-κB由抑制状态被激活从而引发NF-κB转位入核并激发一系列后续免疫反应。另一条转导途径是P38介导的MAPK途径。这是一条经典炎性反应途径，又称为NAPK应急信号通路。Yiqun Zhang等[15]也曾报道过，活化的TRAF6可通过结合转接转蛋ECSIT，作用于MAP-3的激酶MEKK-1，经过P38进一步刺激丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），进而激活c—Jun／Fos，最终引起免疫应答。

3 TLR9介导的信号通路与自身免疫性糖尿病发病

近来的一些重要研究提示：TLR9信号通路不仅在感染诱导的炎症损伤中起到作用，而且在自身免疫性糖尿病的发病中也起到重要作用。Wong等[17]将NOD小鼠的TLR3和TLR9两个基因分别敲除，结果在TLR3缺如和杂合型NOD小鼠中，发病率无显著性差异。然而TLR9缺如小鼠则较TLR9杂合子的NOD小鼠表现出明显的保护作用。Zhang等[15]最近观察到：单独或联合使用CpG寡脱氧核苷酸或CD40(共刺激分子)能激活致糖尿病性T细胞和诱发8.3-TCR转基因鼠糖尿病的发病。而TLR9抑制肽段则阻滞了8.3-TCR转基因鼠糖尿病的发病，氯喹（TLR受体阻滞剂）延缓了NOD鼠的糖尿病的发病，同时观察到胰腺旁淋巴结中的DC的激活减少。

TLR9介导的免疫信号通路，几乎是NF-κB依赖性的，NF-κB在炎症介质的产生和抗体释放中起到至关重要的作用。CpG-DNA刺激TLR9-MyD88信号通路，导致IRAK和TRAF6的磷酸化，最终通过激活NF-κB起作用[14.15,16]。

4 小结与展望

综上所述，CpGDNA/ODN激活TLR9后,哺乳动物细胞内的天然免疫应答和适应性免疫应答均被激活，调节炎症细胞因子的分泌，诱导机体产生以Th1型占优势的免疫应答。但是，对于CpGODN/TLR9介导的细胞转导通路的机制还有一些疑问，如与病毒感染密切相关的自身免疫性内糖尿病是如何通过TLR9介导的信号转导改变细胞因子及共刺激分子表达、影响APCs功能，从而引起T细胞过度活化，产生针对自身抗原的T细胞，打破免疫耐受等具体机制还有待进一步研究。相信随着对TLR9信号通路研究的不断深入，自身免疫性糖尿病的发病机制将会得到进一步的阐明，必然会提高对该类糖尿病的预防和治疗水平。

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