食品致病菌的多重P C R检测分析

关桂英 王风朝

山东莘县疾病预防控制中心检验科，山东莘县 252400

食物中毒有很大一部分是因为食用细菌性食物，而在食物中毒时，如何快速准确的检测出病症根源依旧是检测机关开展工作的难点。传统的诊断办法是对吸入食物的残留样品进行细菌学培养观察，最终得出结论，但是这种方式耗时长、资源消耗大，并且容易造成污染，另外检测受到培养技术的过多局限，容易造成检测结果不准确等问题，常规PCR检测只能针对性地检测出单个细菌体，所以在涉及较多细菌时，其检测的工作量较大，与传统的检测方式一样存在缺陷，另外多重PCR检测技术也由于其特异性和敏感性不高，同样在食品检测中存在不足，因此将以上两种检测方式结合，优化PCR检测流程和方式，使其能够同时检测致病的六种病菌，提高检测效率的同时也保证了检测的准确性。本文正是基于此，对多重PCR检测体系进行深入研究，具体研究成果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 试剂资料 实验主要试剂为Taq酶、PCR缓冲液以及细胞裂解缓冲液，均购买于Promega公司。试剂盒为琼脂糖DNA纯化试剂盒，由青岛生物科技公司制作，6对主要对引物均来自上海生物科技公司。

1.1.2 检测仪器 包括Centri-fuge FRESCO 17低温告诉离心机、DYY-6C电泳仪器、HDLⅡ生物安全柜、SPX-250B-Z培养箱、超纯水以及凝胶成像系统。

1.1.3 菌种类型 包括蜡样芽孢杆菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、肠毒性大肠埃细菌、血性弧菌、葡萄糖细菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌，均由本市疾控中心提供。

1.2 一般方法

1.2.1 菌株培养 将沙门菌融于氯化镁孔雀绿肉汤中，保持37°C的温度持续培养1d；志贺菌接种于GN增菌液，保持37°C培养1 d；肠毒性大肠埃希菌与营养肉汤相接种，同样维持37°C的温度培养1d，副融血性弧菌与碱性蛋白胨水相接种，保持37°C培养18h，葡萄球菌与胰蛋白胨大豆肉汤，保持37°C培养1 d，蜡样芽孢杆菌与胰酪胨大豆多黏菌素肉汤，保持37°C培养约20 h。

1.2.2 PCR引物设定 首先根据美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库明确6种微生物的DNA序列，利用DNA序列数据库的众多资源研究特异属性，后开展靶序列选取，找到这6中致病细菌的对应PCR引物，当引物设计完成后利用Blast能够计算两个序列中具有相似性序列的功能，挑选出与DNA序列数据库的同源性低于40%的PCR引物，并且保证两者的特异性。

1.2.3 样品采集 主要采集100例食物中毒患者的呕吐、腹泻物共计146份，还包括携带病菌的食物或饮品。

1.2.4 常规PCR反应循环参数 首先保持温度在95°C，持续3min，单个循环过程温度保持94°C，时长30 s，一共反映35个循环，待58°C时停火1 min，而72°C时延伸1min，等循环完成后，延伸10min，使温度下降至16°C，4°C时存储产物，以便于下次使用。利用凝胶成像系统和3%琼脂糖凝胶电泳检查5 μL PCR产物，剩下的均4°C进行保存。

1.2.5 常规PCR退火温度控制 基于6种主要致病细菌的退火温度设定PCR反应的退火温度范围在50～62°C，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，后通过电泳图条带的亮度反映来控制退火温度。

1.2.6 多重PCR反应循环参数 保持95°C下预变性3 min，持续40个循环，每一循环维持 94°C 变性 30s，62°C 停火 1 min，同样于72°C时延伸1 min，40个循环均完成后延伸10 min，待其冷却到16°C，4°C时存储产物，同样利用凝胶成像系统和3%琼脂糖凝胶电泳检查5 μL PCR产物，剩下的均4°C进行保存。

1.2.7 多重PCR退火温度控制 以肠毒性大肠埃细菌、蜡样芽孢杆菌以及副溶血性弧菌为例，基于多重PCR反应系统设计以上三种病菌类型的退火温度为48～72°C，同样使用琼脂糖凝胶电泳检测方式，根据电泳图条带呈现的亮度情况选择适当的退火温度。

1.2.8 常规以及多重PCR检测敏感度对比 测定选取的葡萄球菌、肠炎沙门菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA浓度，并且使其变为20ng/μL，并且进行十倍稀释，保证敏感度测验的DNA浓度在 2×10-2～2×10-10ng/μL， 后在每个浓度中各选择 2μl进行常规以及多重PCR检测对比。

2 结果

2.1 常规PCR检测与多重PCR检测灵敏度对比结果

通过常规PCR检测和多重PCR检测的敏感度比较，经过10倍稀释后的葡萄糖菌、蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA、肠炎沙门菌得知，常规PCR在DNA含量较低的情况下仍旧可以反映出清晰特异性的目的条带，而多重PCR只能扩增出葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌，当 DNA 浓度低于 2×10-2～2×10-1ng/μL 时，无法检测出蜡样芽孢杆菌，而低于 2×10-2～2×10-3ng/μL 时，只等对葡萄球菌进行扩增，DNA 浓度不高于 2×10-2～2×10-7ng/μL 时候无法扩增。由此得知常规 PCR 检测敏感度为 2×10-2～2×10-7ng/μL，多重PCR的检测敏感度是 2×10-2～2×10-6ng/μL。

对100例患者146份食品中毒样本进行以上两种检测，发现副溶血性弧菌均可检测出来，但是两种PCR检测对比分析后，常规PCR能从较多的样品中检测出这一细菌，而多重PCR检测相比而言从样品中检测出副溶血性孤菌的概率较低。

2.2 常规PCR、多重PCR退火温度优化

常规PCR反应在退火温度不高的的情况下，例如50°C的退火温度，6种主要致病菌都能反映出特异性扩增条带，但条带亮度呈现效果不明显，而当温度较高，处在58°时反应出的电泳条带更为清晰，因此可以说温度较高的情况下达到的PCR检测结果也更为满意。但是温度过高，即到达62°C时，葡萄球菌产物反应不明显，并且容易导致肠炎沙门菌产物丢失。所以根据分析发现常规PCR检测保持58°C的退火温度能达到最好的检测效果。

根据对蜡样芽孢杆菌、副溶血性孤菌以及肠出血性大肠埃希菌三种菌种的引物检测为例进行的多重PCR检测退火实验得知：多重PCR检测在退火温度为50°C时，以上三种致病菌的特异性扩增条带反映效果一般，仅能体现很低的条带亮度，但当温度到达62°C时，电泳条带的亮度反映情况良好，便于分辨，得到的PCR检测结果也更为确切。当温度到达70°C时，蜡样芽孢杆菌引物会发生丢失，所以得出多重PCR检测退火温度在62°C时效果最佳的结论。

3 结语

由以上检测结果得知，传统的检测方式对于一些特殊病菌的培养和检测存在技术盲区，同时有敏感度弱、特异性低、检验工作量大、检测时间长等众多缺陷，难以满足对病菌食物起到检测和预防的目的，所以具有众多优势的多重PCR检测方式亟需进一步使用和优化。多重PCR检测技术首先应用于异基因脐带血干细胞治疗假肥大型肌营养不良症中。目前多重PCR诊断技术已经普遍用于基因组结构、基因座定位或者病源细菌检测等多种用途中，并且通过长时间的使用，其检测质量也得到的肯定，尤其是能够检测出副溶血性孤菌、单核细胞增生李斯特菌以及沙门菌方面能够在保证检测质量的前提下缩短检测耗时。

通过以上实验研究得知常规PCR检测的敏感度在2×10-7ng/μL，所以高于多重PCR检测的敏感度，对于食物中含有的病菌检测也较为有效，但是消耗大量的试剂以及时间。多重PCR检测与其相反，虽然灵敏度不如常规PCR检测，但是能够缩短检测时间，并且能够同时检验出多种类病菌类型，所以将常规PCR检测与多重PCR检测相结合，取长补短的优化检测方式，建立一个具备高效、敏感、准确的PCR检测方式，能够使6中治病的主要病菌类型在最快时间内被全部检测出来。

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