细胞因子IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究

韦冠东，张元鑫，汤德元*，曾智勇，马 萍，刘 霞，王洪光，李 达

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵阳 550008）

DNA疫苗的免疫效果受动物个体差异的影响较大，如何提高和改善DNA疫苗的免疫效果是当今DNA疫苗研究的热点，近年来研究发现：与DNA疫苗联合应用的细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA疫苗免疫效应，白细胞介素作为免疫佐剂能协同DNA疫苗取得较好的免疫效果。随着分子生物学和免疫学技术的发展，利用白细胞介素IL-2和IL-4等作为疫苗的免疫佐剂已成为免疫佐剂的研究热点。本文主要综述了IL-2和IL-4作为免疫佐剂对病毒保护性抗原基因真核表达的影响，以期为更深入地进行IL-2和IL-4对DNA疫苗增强作用的深入研究提供参考。

1 IL-2和IL-4的生物学作用

白细胞介素作为免疫分子佐剂已经在多种传染性疾病的防治领域得到了广泛的应用，其中IL-2的应用最为普遍，其次为IL-4。

IL-2是活化的T细胞产生的Th1细胞的特征性因子，虽然其没有直接的抗病毒活性，但其能刺激T淋巴细胞快速增殖和分化，并产生多种其它细胞因子如IFN-γ，IL-4，IL-S，IL-6，TNF-β及CSF等，对免疫应答具有广泛的上调作用。IL-2能够维护整个NK细胞的活化、分化和增殖，调节NK细胞并保持其自然杀伤力；诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖；诱导淋巴因子活化淋巴细胞产生；具有促进B淋巴细胞增殖、分化作用；以及协同其他白细胞介素发挥作用。

IL-4是活化的T细胞产生的Th2细胞的特征性因子，能够促进以Th2细胞为特征的免疫应答，增强B细胞介导的体液免疫应答。对于B细胞、T细胞、肥大细胞和巨噬细胞等都有免疫调节作用，能够调节T、B淋巴细胞的分化、活化；增强抗原递呈细胞功能；协助基因疫苗持续表达高水平特异性抗体。随着对其免疫调节作用研究的深入，发现IL-4基因与高效表达载体组成重组质粒可以长时间持续表达，增强基因疫苗的免疫原性，提高机体免疫防御能力，有效发挥佐剂效应。

2 IL-2和IL-4对病毒抗原基因真核表达影响的研究

许多研究发现：利用细胞因子IL-2和IL-4全基因分别构建的真核表达质粒普遍能提高病毒抗原基因真核表达的效果。

陈慧慧[1]等所在实验室构建了CPVVP2、cIL-2和cIL-7真核表达载体，同时利用含内部核蛋白进入位点（IRES）的真核表达载体构建了cIL-2和cIL-7双基因表达质粒。对4组小鼠分别进行VP2单免疫、VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫，结果显示共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价均高于VP2单免疫，同时VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组显著高于VP2+cIL-2和VP2+cIL-7共免疫组(P＜0.05 )，表明cIL-2和cIL-7基因对CPV VP2 DNA疫苗免疫原性具有明显的协同效应。希尼尼根[2]等构建真核表达质粒pcDNA-IL-2，将pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共同免疫仔猪。实验设pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共 免 疫 组、pcDNAPRRSV-SC2-ORF5单 免 疫 组、pcDNA3.1（+）空载体和灭菌水免疫组。实验结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫组和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫组的IgG含量、CD+和CD+48细胞比例、外周血T淋巴细胞的增殖活性与单免疫组相比均显著增高。说明猪pcDNA IL-2具有促进体液免疫和细胞免疫功能的作用，能显著提高pcDNAPRRSV-ORF5基因疫苗的免疫效果。

张建远[3]等用构建的pcDNAPCV-ORF2重组质粒与5种细胞因子质 粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表达质粒）联合对仔猪进行免疫实验。免疫后通过流式细胞仪测定血液中CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚类的数量以及间接ELISA法测定猪圆环病毒II型特异性抗体IgG，结果显示CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚类的数量及特异性抗体IgG均显著增高，说明细胞因子质粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表达质粒）均可显著提高DNA疫苗的免疫效果。

贵州大学动物科学学院汤德元[4]等构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因真核表达质粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-4并 免疫仔猪，实验设pcDNA-ORF5免疫组、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-2免疫 组、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-4免疫组和pcDNA-ORF5+pcDNAIL-2+pcDNA-IL-4联合免疫组。结果显示真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以增强机体对猪繁殖与呼吸综合征核酸疫苗pcDNAORF5的免疫应答，且pcDNAORF5+pcDNA-IL-2+pcDNA-IL-4联合免疫组的免疫增强效果更为显著。

3 IL-2和IL-4分别与病毒抗原基因构建融合真核表达载体的研究

利用IL-2和IL-4分别与抗原基因构建的融合双表达重组质粒应用可增强机体对DNA疫苗的免疫应答。

陈创夫等构建猪瘟病毒E2基因与IL-2、IL-3基因的真核双表达载体（pIRST IL-2，pIRST IL-3），并将其分别导入小鼠体内，观察其表达水平，及IL-2、IL-3对DNA疫苗的免疫增强效果。实验结果显示pIRST IL-2、pIRST IL-3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强，表明IL-2、IL-3作为基因佐剂能明显增强猪瘟基因疫苗的免疫效果。肖义蓉[5]等实验结果显示重组质粒pcDNA-IL-2与pcDNAEIII'.VP2共表达组与pcDNA-IL2-EIII'.VP2融合表达组JEV/PPV抗体水平明显高于空载体对照组，说明IL-2重组质粒能显著增强核酸疫苗免疫原性，其中融合基因形式构建的真核质粒pcDNA-IL2-EIII'.VP2免疫增强效果更明显。徐凯等将构建的重组质粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2免疫BALA/c鼠，同时设立猪细小病毒灭活苗组、猪圆环病毒亚单位苗组和pCI空载体对照组，以检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能，外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清PCV2、PPV抗体效价。结果显示重组质粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2二免后小鼠均产生良好的免疫应答，其中脾脏淋巴细胞转化功能，CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值均高于或显著高于其他3组。表明猪IL-2作为基因佐剂能显著增强VP2/ORF2'核酸疫苗诱导的免疫应答。

贵州大学动物科学学院汤德元、王洪光[6]等将构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-gE1，pcDNA3.1(+)-IL-2，pcDNA3.1(+)-gE2-IL-2分别免疫小鼠和仔猪，实验设pcDNA3.1(+)-gE1免 疫 组，pcDNA3.1(+)-IL-2免 疫 组，pcDNA3. 1(+)-gE1和pcDNA3.1(+)-IL-2联合免疫组，pcDNA3.(+)-gE2-IL- 2融合蛋白免疫组，空载体组和生理盐水组。结果显示联合免疫组及融合蛋白免疫组小鼠和仔猪血清抗体效价均高于其他实验组，同时联合免疫高于融合蛋白免疫组，但差异不显著，说明联合免疫组及融合蛋白免疫组均能一定程度诱导小鼠和仔猪产生体液免疫；联合免疫组及融合蛋白免疫组小鼠和仔猪CD4+、CD8+、CD4+CD8+淋巴细胞水平均显著高于其他实验组，同时联合免疫组显著高于融合蛋白免疫组，说明联合免疫组及融合蛋白免疫组诱导小鼠和仔猪产生细胞免疫，但效果不显著。

细胞因子IL-2和IL-4真核表达质粒与病毒抗原基因构建的真核表达载体联合免疫动物、细胞因子IL-2和IL-4与病毒抗原基因构建的融合双表达重组质粒免疫动物，两者都能增强真核表达的效果，但关于两者之间免疫效果的比较研究没有得到一致结论，也有许多实验表明：并非所有融合蛋白都发挥出其预想的协同效应，这可能是由于相连的两种分子在肽链折叠过程中相互干扰，不能形成天然空间构型，从而影响了其生物学活性有关，由此可见，无论是细胞因子IL-2和IL-4真核表达质粒与病毒抗原基因构建的真核表达载体联合免疫动物或者是细胞因子IL-2和IL-4与病毒抗原基因构建的融合双表达重组质粒免疫动物，其免疫效果，都有待于进一步深入研究。

细胞因子用作免疫佐剂诱导基因疫苗发挥更有效的免疫作用是未来基因疫苗发展的趋势，相信随着分子免疫学和疫苗研究等相关学科迅速发展，利用细胞因子作为免疫佐剂疫苗的免疫开发研究会克服重重困难取得预期的效果。

[1] 陈慧慧. IL-2与IL-7基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗的协同免疫增强作用[D].河北农业 大学，2013.

[2] 希尼尼根，程安春，汪铭书，等. 猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSVORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究[J].畜牧兽医学报，2007（9）：1003-1008.

[3] 张建远，王红宁，陈锦锐，等. 猪圆环病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的构建及分子佐剂联合免疫研究[J].中国兽医学报，2009，12：1511-1515.

[4] Deyuan Tang， Jian Liu， Chunyan Li， et al.Positive effects of porcine IL-2 and IL-4 on virus- specific immune responses induced by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF5 DNA vaccine in swine[J]. Vet Sci. Mar 2014，15(1)：99-109.

[5] 肖义蓉，王印，郭万柱，等. 猪IL-2对pcDNA-E39.VP2真核共表达质粒免疫原性的影响[J].中国兽医学报，2011，31（7）：937-941.

[6] 王洪光，郝飞，汤德元，等. 伪狂犬病病毒gE基因DNA疫苗在动物体内诱导的免疫应答及IL-2对其作用影响[J].畜牧兽医学报，2014，45(9)：1488-1496.