猪伪狂犬病病毒的检测方法研究进展

顾 凡，黄 山，刘鹏娟，黄剑波，卓秀萍，朱 玲

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川 雅安；2.四川省雅安市石棉县畜牧局，四川 雅安）

伪狂犬病(pseudorabies，PR)又称奥叶兹基氏病，是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科中的伪狂犬病病毒(PRV或 ADV)引起的一种或多种动物感染的急性传染病，其中猪最易感，发病也最严重，是病毒的长期储存者和排毒者，且具有高致死率，这无疑给养猪业带来了巨大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的多动物病毒共患病，该病自1902年在美国发现以来曾在全球范围内流行。目前一些国家已经成功根除了这一疾病，但在我国，该病在大多数养殖区域依然存在。为了预防、控制进而最终根除该病，研究人员对该病进行了广泛的研究，在国内外研究人员的不懈努力下，建立了若干病原学、血清学、分子生物学等检测方法。以下是这几类主要方法的综述。

1 病原学检测方法

1.1 病理组织学检测

成年猪主要表现为隐性感染，无明显症状；母猪流产或产死胎，仔猪表现发热、昏迷、神经症状、肌肉震颤，严重时四肢划水样运动，体温升高达42 ℃。取样本的脑和脊髓做组织切片，苏木素-伊红染色后观察呈现非化脓性脑炎变化，其他部分剖检特征不明显。在神经细胞、胶质细胞和毛细血管内皮细胞可检出A型核内包涵体，眼观主要见肾脏有针尖状出血点，其他肉眼病变不明显。

1.2 病毒分离检测

病毒分离是采取病死猪或处于发热期病猪的脑组织（中脑和脑桥含毒量最高）、肾及扁桃体等组织来分离病毒，经灭菌的平衡盐溶液或生理盐水稀释后接种在被培养成单层的细胞上，观察至出现特征性细胞病变。病毒分离鉴定是诊断该病的可靠方法，被认为是诊断该病的“金标准”[2]。研究表明，用病毒分离免疫荧光染色和核酸探针杂交的方法分别检测实验室感染的一株PRV，结果显示，病毒分离方法和核酸探针杂交方法在检测病料上具有很好的一致性。

1.3 动物接种试验检测

取分离的病毒上清液，在家兔腹侧皮下注射2 mL/只。开始时家兔精神萎靡，食欲不振，于接种后8 h和10 h左右体温上升最终达到39.5～41.5 ℃。2～3 d后，注射局部出现奇痒症状(啃咬注射部位)，致使皮肤破损出血，随即后肢麻痹，卧地不起，不时出现痉挛，维持1～2 d后抽搐死亡。鸡胚接种3～4 d后，鸡胚死亡。囊膜水肿、充血、出血，并有数量不等、大小不一白色痘斑样病灶，胚体萎缩，头盖部突起，全身弥漫性出血。可通过此现象判断为已感染伪狂犬病病毒。

1.4 病毒粒子的形态观察

伪狂犬病病毒有疱疹病毒的一般形态特点，即病毒粒子呈椭圆形或圆形外观，位于细胞核内，无囊膜的病毒粒子直径约为110～150 nm，位于胞浆内带囊膜的成熟粒子直径为150～180 nm。囊膜表面有呈放射状排列的纤突，长度约为8～10 nm。核心致密，未成熟的病毒粒子呈中空状。

2 血清学检测方法

2.1 中和试验

血清中和试验技术(SNT)是检测病毒比较经典的血清学方法，应用比较方便，很多国家都采用此法检测PRV，方六荣等[3]用MSNT进行了PRV的血清学调查。通过监测中和指数和中和效价，发现MSNT的特异性很强，但敏感性较低。邱德新等[4]应用血清中和实验(SNT)和伪狂犬病乳胶凝集实验(LAT)诊断试剂盒进行了PRV抗体效价测定和相关性分析，结果表明2种方法检测结果符合率高，特异性强，快速简便和实用。

2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为广泛应用的一种免疫检测方法，是被国际贸易指定检测PRV的方法之一[5]。世界动物卫生组织(OIE)将其作为检测猪PR的首选血清学方法。美国也将ELISA作为PR的3种法定检测方法之一。它是以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固体载体上，随后的一系列免疫学和酶促生化反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定实验。酶联免疫吸附试验适用于实验室大批样品检查，产地检疫，流行病学调查和无本病健康猪群的筛选建立。

包 括 gE-ELISA，gC-ELISA，gG-ELISA ，gE-ELISA是一种灵敏度很高的ELISA，它是根据疫苗株缺失的糖蛋白构建的一种鉴别ELISA。国内蒋玉雯等[6](1988)建立了检测伪狂犬病病毒抗体间接ELISA方法，认为ELISA敏感性高，且快速、简便，适于大面积血清学调查。Oirschot等通过ELISA中和试验检测感染猪血清，进行比较后发现，gC-ELISA和gE-ELISA方法较为敏感；Marchioli和Cook等建立了阻断gG-ELISA技术，该方法较常规ELISA方法敏感性低[7]。唐勇[8]在克隆表达的基础上建立了gG-LAT、gG-ELISA 和 gE-LAT、gE-ELISA。结果表明，gG-LAT和gG-ELISA特异性强、敏感性高，目前，国际上有各种商品化ELISA试剂盒出售。汪招雄等[9]以猪伪狂犬病病毒(PRV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PRVIgG为检测抗体，建立了检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果表明，双抗体夹心间接ELlSA方法也具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PRV的检测。

2.3 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验技术(LAT)是利用抗原和抗体特异性结合的特点，将抗原先用乳胶包被，然后再与相应血清反应，几分钟内即可得出结果。美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用，LAT操作简单、方便、快速，且敏感性高、特异性强，据实验比较，LAT比SNT敏感、适用于疫病监测或流行病学调查，以及种猪群检疫净化阳性猪的初次筛选。另一方面，查找及消除非特异性凝集是今后努力的目标之一。

2.4 血凝试验与血凝抑制试验

该方法利用伪狂犬病毒能够凝集某种动物红血球，HA可被抗伪狂犬病病毒的高免血清特异性抑制的原理来达到检测伪狂犬病病毒的目的。吴平等[10]用单克隆抗体致敏绵羊红细胞建立了反向间接血凝抑制试验(HI)，廖文军[11]等以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)-PRV gE蛋白双功能融合蛋白为抗原，建立了检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的红细胞凝集试验[12]。与美国进口的PRV抗体检测gE-ELISA诊断试剂盒比较，红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性、特异性较高的特点，可用于PRV野毒感染的快速筛查。王云龙等[13]（2009)经实验室对比试验及临床样品检测也证实红细胞凝集试验具有简便、特异、快速、适于基层养殖者使用的特点，在兽医的检测技术上具有很好的应用前景。

2.5 免疫组化

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等，利用抗原抗体特异性结合原理和组织化学方法，使其结合部位显示出来，以达到对动物组织或细胞中的抗原的定位、定量、定性的研究。其中运用得较多的为免疫荧光试验(FA)，在1995年建立的荧光抗体染色（FA）技术可直接检测组织培养、实验感染和自然感染的动物病料中的PRV，同时做了阻断试验和 TGEV、PEDV、HEV、RV、CDV、BEFV、BVDV 等交叉检测试验，证明该诊断方法具有较高的特异性和敏感性。荧光抗体染色具有特异性强、精确性高和操作简单的优点，是一种快速检测PRV的方法。另一种常用方法，胶体金免疫层析，利用PCR技术从PRV基因组中克隆gE抗原表位基因，将其插入到载体中，构建成原核表达质粒，并诱导其表达，表达产物纯化后作为抗原，结合胶体金标记技术，利用双抗原夹心法在国内首先建立了PRV gE抗体检测的免疫层析试纸条。此后，廖文军等也制作出检测PRV gE抗体的双抗原胶体金试纸条，其特异性和敏感性与美国IDEXX和法国LSI gE-ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果一致。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，适合猪伪狂犬病的临床诊断及猪伪狂犬病野毒感染的快速筛查。

2.6 琼脂免疫扩散试验

利用微量琼脂扩散试验(AGID)检查猪血清中PRV抗体，AGID的原理是抗原和抗体在琼脂中自由扩散相遇后发生肉眼可见的沉淀。由于AGID技术操作简单，结果准确，特异性好，无需特殊设备，与SNT技术相比有很大的优势，因此适用于基层兽医单位和大型猪场的现场的定性诊断及猪群有无隐性感染的普查。

2.7 免疫电泳技术

免疫电泳技术(IE)是利用凝胶电泳与双向免疫扩散2种技术结合的实验方法，建立了对流免疫电泳方法（CIE）检测猪PRV血清抗体，研究人员又以中和试验做参考，对比研究了CIE和微量免疫扩散试验（MID）对PRV抗体检测的效果，结果表明两者敏感性相近，却都不如中和试验敏感。但是 CIE 和 MID 方法对血清质量要求不如VN方法严格。同时CIE表现出的快速诊断优势很明显，特异性好，无交叉反应。

3 分子生物学方法

3.1 核酸探针技术

核酸探针又称核酸杂交，利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列(靶序列)的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。郭万柱等[14]建立了用32P标记PRV全基因组DNA和重组质粒PSAGI-19 DNA作探针检测PRV的DNA的斑点杂交法，2种探针均能检测到10 pg的PRV DNA，但由于同位素标记探针的放射性污染及危害使其应用范围受限。在PCR出现之前，原位杂交是短时间检查 PRV 潜伏感染最敏感的方法[15]。此后，刘志杰等[16]利用PCR技术扩增gE基因片段，制备了地高辛标记的gE基因核酸探针，特异性好，对PRV野毒的最低检出量为4 pg，敏感性高，与PCR检测结果一致，表明该核酸探针技术灵敏性得到了提高，此后，国内学者相继利用伪狂犬病病毒保守性强的gp50基因扩增产物制成地高辛标记的探针，该探针的灵敏度达到 2pg DNA。即可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。由于核酸探针具有特异性强、敏感性高等特点而被应用于PRV的诊断。DNA杂交技术虽然具有很高的敏感性，然而操作步骤比较繁琐，需要提纯DNA，仅限在条件较好的实验室应用。

3.2 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，通过测序对比来达到检测病毒的目的。Belak等建立了检测PRV gB 基因的PCR方法，应用它可以从PRV感染细胞、鼻细胞、急性与慢性感染的脏器中检测到DNA，其中检出率最高的组织为三叉神经节，几乎为100%。Harding等建立了扩增PRV gD 基因以区分来自人和其他动物疱疹病毒的PCR方法。国内学者又建立复合 PCR，可用于扩增 PRV gB、gE 基因，可有效地鉴别野毒感染和疫苗接种[17]。孙德刚等[18](2007)，建立了扩增 PRV gD基因的PCR 方法，其特异性都较之前好。期间还有实时荧光定量PCR[19-21]，针对临床上的混合感染问题又建立了多重PCR方法。潘群兴等[22]建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法；曲光刚等[23]建立了PRV、PPV双重PCR检测方法，具有良好的特异性和敏感性；岳丰熊[24]建立了一种能够同时检测PCV2、PPV、PRV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)；国外研究人员又建立了快速检测PRV、PPV、PCV1和PCV2的多重PCR方法[25-26]；LeeCS等[27]建立了可同时检测猪体内伪狂犬病病毒、细胞巨化病毒和猪圆环病毒的多重PCR方法；YueF等[28]建立了快速检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重PCR方法。通过不同组合可检测出1种或多种病毒。此后国内研究者又参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列，设计了5对引物扩增其目的片段，通过对反应条件的优化建立了检测CSFV、SIV 、PCV2、PRV 和 PRRSV 的 多 重PCR(mPCR)诊断方法[29]。敏感性和特异性结果显示，该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10 pg。PCR技术检测PRV具有敏感性高、特异性强、快速、简便、适合应用在PRV的临床检测工作中。

3.3 环介导的恒温检测方法

环介导的恒温检测方法(LAMP)是一种快速简便特异的检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测。研究表明，利用该方法所建立的反应体系在恒温65 ℃水浴锅中作用60 min便可得到环介导恒温反应所特有的阶梯状条带，而猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和健康猪睾丸细胞的扩增结果均为阴性，该检测方法的敏感性是普通PCR方法的100倍。LAMP核酸检测方法在检测PRV早期感染方面具有显著优势，如果能组装成核酸检测试剂盒，将会是就地临床检测PRV野毒感染的有力检测工具。

3.4 基因芯片

基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片，genechip）技术作为一项高新技术，在面积不大的载体上如玻片上可实现对多种目的基因的同时检测[30]。它是基于PCR技术和核酸杂交的原理，事先对载体表面进行特定处理，将寡核苷酸片段或cDNA片段有序地、高密度地排列于固相载体上，形成DNA微阵列，用高精密度的激光共聚焦荧光检测系统进行杂交信号的检测[31]。将gE基因作为目的基因，并根据其基因设计引物与探针，采用不对称PCR技术扩增目的基因，将探针固定在表面经过醛基化处理过的芯片上来检测猪伪狂犬病病毒，构建了PRV病原检测基因芯片，达到了对猪伪狂犬病病毒检测的目的[32]。

4 其他方法

除以上常用的检测方法外，还有补体结合试验、皮肤变态反应试验、放射免疫试验、对流免疫电泳等试验检测方法。

5 讨论与展望

伪狂犬病病毒属于疱疹病毒， 一旦感染就会终身带毒， 注射疫苗虽能减少其发病， 但是不能完全阻止其感染和排毒， 在应激条件下( 如密度过大、混群、转栏、分娩等)，潜伏的病毒就会被激活，反过来影响其他正常猪。故开展种猪PRV的净化是解决感染的首要问题。而要进行净化，建立能有效区分野毒感染和疫苗免疫的鉴别检测方法则相当重要。gE抗体检测试剂盒是一种阻断gE-ELISA，由于目前普遍使用gE基因缺失疫苗，因此通过gE-ELISA方法可以将疫苗免疫猪和野毒感染猪区别开来，在亚临床感染和隐性感染的诊断中具有显著优势。通过gE-ELISA的血清学检测以及基于gE基因的PCR方法对发病猪检测是目前实验室诊断中广泛使用的方法。在规模化猪场进行全群采样或抽样后进行gE抗体和基因的检测，并根据检测结果进行隔离或淘汰处理，有计划地进行检测可以显著降低猪场的伪狂犬病病毒感染率，通过数次的检测淘汰可以在某些猪场根除猪伪狂犬病病毒感染。因此在检测方法中gE基因的检测方法是将来根除猪伪狂犬病的主要方法也必将在猪伪狂犬病的净化中发挥重要作用。

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