指纹图谱技术在中草药黄芪鉴别中的应用

宁玉门

（商丘职业技术学院，河南省商丘市 476000）

每个人都有指纹，但指纹却各不相同，每一味中药的特性和有效成分也千差万别。通过提取这些特性，结合现代分析技术手段，将中药的特性和有效成分表征出来(即指纹图谱)，此过程是用指纹图谱来评价中药质量的基础和关键。用适当的分析手段进行中药指纹图谱研究是非常必要的。

1 中草药指纹图谱技术在中草药质量评定中的应用

1.1 稳定、质量可靠的中药材是建立指纹图谱的基础。中药材是生产中药饮片和中成药的重要原料，是保证中药饮片和中成药质量的关键和根本。中药材的各种成分不仅因品种而异，也与其生长环境、采收时间、炮制与贮存过程有关，因此中药材的质量非常不稳定，这对于开展中药材指纹图谱的研究是极其不利的，多种多样的中药材很难制订出稳定可靠的指纹图谱。因此必须选择足够多的样本，作为指纹图谱的研究对象。

1.2 中药材指纹图谱的获得和评价方法 以经生药学鉴定的中药材为研究对象，用TLC、TLCS、HPLC、HPLC／MS、GC、GC/MS、MPCE等 现 代 分析技术对样品进行分析，获取化学数据；并在药效学指导下进行指纹图谱研究，能够保证指纹图谱反映的化学成分包括中药材中有效部位所含绝大部分成分，或者有效成分的全部，将其综合分析可以对中药材的优劣与真伪作出判别。

1.3 中药材质量的再评价 选择10批此中药材，按照已经建立的分析处理方法，获取样品的指纹图谱，以此指纹图谱作为该中药材的质量控制指标之一。将未知样品的指纹图谱与已经建立的标准指纹图谱进行比较，即可评价未知样品的真伪优劣。

2 中药材黄芩HPLC指纹图谱检测

2.1 仪器与试剂 仪器和设备:高效液相色谱仪,超声波清洗器，电子分析天平。黄芪甲苷对照品,乙腈(色谱纯),纯化水;其余试剂均为分析纯。药材:黄芪均购自亳州中药材市场。

2.2 试验方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱:HypersilODS(4mm×250mm5μm)色谱柱(Agilent1100);流动相:乙腈 -水(30∶70)二元梯度洗脱;流速1mL/min;检测波长203nm;柱温:30℃;分析时间:60min;进样量:20μL。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取各黄芪药材30.00g,剪碎,置具塞椎形瓶中,加甲醇140mL,浸泡过夜后,超声提取10min,将溶液过滤,回收甲醇至干,残渣加水10mL溶解后,转移至分液漏斗中,以水饱和的正丁醇萃取3次,每次20mL,合并正丁醇萃取液,将正丁醇减压回收至干,用甲醇溶解并定容至5.0mL量瓶中,制得样品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芪对照品适量,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成含黄芪1mg/mL的溶液,作为对照品溶液。

2.2.4 流动相的选择 试验过程中,系统比较了不同浓度的甲醇-水(70∶30,55∶45,45∶55)、乙腈-水(70∶30,50∶50,30∶70)等不同体系的二元梯度洗脱系统。试验结果表明,以乙腈-水(30∶70)二元梯度分离度最好,特征峰明显,样品90min图谱显示,60min样品峰即可分离完全、无继续特征峰出现,因此,本文选取乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脱体系为流动相,分析时间为60min。

2.2.5 检测波长的选择 吸取上述样品溶液20μL进样,以乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脱体系为流动相,利用DAD检测器进行全波段扫描检测分析,结果表明,该样品在203nm处有比较显著的特征色谱峰,因此,本文选取203nm作为检测波长。

2.2.6 参照物的选择 通过对不同产地及相同产地不同批号黄芪药材HPLC色谱图系统考察,所有药材中s号峰的含量较高,且较为稳定,因此,选取s号峰作为参照物。测定方法 分别精密量取对照品溶液和各样品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录60min色谱图即得。以黄芪甲苷的色谱峰(s)的保留时间和峰面积为1,计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积的比值。

3 方法学考察

3.1 线性关系 分别精密吸取贮备液100,200,400,600,1100,2000μL,置1mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,取以上溶液各20μL,注入液相色谱仪,按上述条件进行测定,各浓度分别测定2次,以进样量(μg)的常用对数值为横坐标,以对照品峰面积的常用对数值为纵坐标,绘制标准曲线。求得回归方程为:Y=1.0623X+1.633,r=0.9994,进样量在2.061～41.663μg内呈良好的线性关系。

3.2 黄芪甲苷含量的测定 分别精密量取各样品溶液20μL,注入液相色谱仪,按上述方法进行测定,将测出的各样品溶液峰面积的常用对数值代入回归方程,计算出各样品溶液的黄芪甲苷含量。

3.3 精密度试验 取对照品溶液,连续重复进样5次,每次进样20μL,按上述条件进行测定,黄芪甲苷峰面积的RSD为2.44。

3.4 稳定性试验 以内蒙古呼和浩特产黄芪药材为供试品,分别在0,2,8,12,24h进样,按上述条件进行测定,结果表明,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化。说明本方法稳定。

3.5 重现性试验 取内蒙古呼和浩特产黄芪药材5份为供试品,按样品溶液制备方法处理,按上述条件进行测定,结果表明,各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10的峰(1,5,6,s号峰)面积比基本一致。

3.6 样品测定 按样品溶液的制备方法操作,分别取各批药材制成样品溶液,取20μL进样。同前条件测定图谱,结果表明:5个不同产地的黄芪药材有13个共有峰,其HPLC指纹图谱基本一致,共有峰面积之和均大于各总峰面积的90,但其共有峰面积的比值有一定差异。

4 小结

试验结果表明,5个不同产地黄芪药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致。但各成分峰面积的相对比值有所不同,为快速鉴别区分不同来源的药材提供了科学的依据。

本文采用HPLC色谱法,建立了黄芪药材的指纹图谱分析方法。结果表明:方法稳定、可靠、重现性好。