胰岛素抵抗肥胖大鼠血清增食欲素A与IGF-1及脂代谢相关性研究

徐 爽，赵玉岩，沈 扬，郑德禄

中国医科大学附属第一医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001

摘要：目的分析胰岛素抵抗(IR)肥胖大鼠血清增食欲素A(orexin A，OXA)与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)的相关性，阐明IR病理过程中增食欲素A参与脂肪代谢的可能作用机制。方法6周龄SD雄性大鼠，随机分为普通饮食组(NC组)和高脂肪饮食组(HF组)；建立IR肥胖大鼠模型，钳夹技术评定。大鼠皮下注射OXA(0～10-6M)；用酶联免疫吸附法检测血清OXA和IGF-1。结果SD大鼠喂养6周后，高脂膳食诱导的肥胖大鼠(HF组)机体内的胰岛素、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)均明显高于NC组(P<0.05)；HF组大鼠体内的葡萄糖输注率60-120(GIR60-120)明显降低；大鼠皮下注射OXA(10-8M、10-7M、10-6M)，NC组大鼠血清IGF-1水平分别降低25.0%、43.5%、55.6%，IR肥胖大鼠血清IGF-1分别降低11.3%、17.7%、27.4%；IR肥胖大鼠血清OXA与IGF-1、HDL-C呈负相关，相关系数r分别为-0.342、-0.226，P<0.05；与胰岛素、TC、TG、LDL-C呈正相关，相关系数r分别为0.303、0.388、0.255、0.253，P<0.05。结论高脂饮食诱导的IR肥胖大鼠血清内OXA与IGF-1密切相关；OXA减弱IGF-1的含量，进而参与肥胖大鼠机体内IR的发生。

关键词：增食欲素A；胰岛素样生长因子1；胰岛素抵抗；肥胖；高脂肪膳食

文章编号：2095-5561(2014)03-0179-04中图分类号：R 587.1文献标志码： A

Abstract：ObjectiveTo investigate the correlation of orexin A (OXA) with insulin-like growth factor 1 ( IGF-1) in besity rat with insulin resistance induced by high-fat diet.MethodsMale Sprague-Dawley rats model with insulin resistance induced by high-fat diet was verified by euglycemic insulin clamp technique to determine the insulin resistance.The rats were treated with OXA(0 to 10-6M)by hypodermic injection.The serum levels of OXA and IGF-1 in SD rat were detected by luminescent immunoassay enzymic method.ResultsAfter 6 weeks high-fat diet，serum insulin，total cholesterol (TC)，triglyeride (TG) and low density lipoprotein (LDL-C) increased significantly in obesity rats with insulin resistance (P<0.05)，the GIR60-120in obesity rats was decreased significantly ，compared with normal rats.After treated with OXA (10-8M，10-7M and 10-6M) ，the levels of serum IGF-1 decreased 25.0%，43.5% and 55.6% in normal rats,respectively,decreased 11.3%，17.7% and 27.4% in obesity rats,respectively.The correlation coefficient between OXA and serum IGF-1，high density lipoprotein (HDL-C) in insulin resistance rats were -0.342 and -0.226，P<0.05.The correlation coefficient between OXA and serum insulin，TC，TG，LDL-C in insulin resistance rats were 0.303，0.388，0.255，0.253，P<0.05.ConclusionsHigh-fat diet could induce insulin-resistance and obesity in SD rat.OXA correlated with IGF-1 in insulin-resistance in SD rat.That OXA down-regulated serum IGF-1 would involve in insulin-resistance in high-fat diet induced obesity rat.

KeyWords:orexin A ；insulin-like growth factor 1；insulin resistance；obesity；high fat diet

影响胰岛素抵抗(IR)的因素越来越多的被国内外学者研究和发现，如瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子-α、葡萄糖转运蛋白-4、脂联素、增食欲素等[1]。增食欲素A(OXA)是表达于下丘脑、室旁核、脑干、肾上腺等组织中的神经肽，主要参与机体的食物摄取及能量平衡代谢。胰岛素样生长因子1(IGF-1)是IGFs家族重要成员，啮齿类动物体内肝及其它组织局部产生IGF-1，而IGF-1的自分泌或旁分泌作用对正常生长及能量代谢非常重要。有实验证明，IGF-1与多种脂肪因子有关联，能调控瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子-α等蛋白的表达[2]，但目前关于IR大鼠机体内OXA与IGF-1相关性的研究较少。本研究旨在通过建立IR大鼠模型，分析不同浓度的OXA对IGF-1水平的影响，为IR及相关代谢综合征的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立 6周龄SD雄性大鼠75只，按随机数据表分为普通膳食组(NC组，n=20只)和高脂肪膳食组(HF组，n=55只)。普通饲料由中国医科大学动物中心提供。热量比：蛋白质28%，脂肪12%，碳水化合物60%。高脂饲料配方：100 g高脂饲料包括基础饲料55 g，猪油30 g，奶粉10 g，蛋黄粉5 g。热量比：蛋白质20%，脂肪59%，碳水化合物21%。膳食配方参考文献[3]。附加必需维生素及矿物质，每只大鼠每天供给热量310 kJ。喂养6周后行钳夹技术[4]及相关指标测定。

1.2 钳夹技术评价

1.2.1 插管 NC组随机选取6只大鼠，HF组随机选取17只大鼠，麻醉后行颈动脉插管并接装有肝素生理盐水的注射器，两侧股静脉插管分别接安装在输液泵上的装有胰岛素(insulin，Ins)和10%葡萄糖溶液的输液瓶。

1.2.2 输注 将大鼠颈动脉取血，用微型血糖仪测定基础血糖值，然后开始持续胰岛素静脉输注[1.67 mU/(kg·min)]。血糖值超过基础值±0.5 mmol/L的范围时，即开始葡萄糖输注。葡萄糖输注率(glucose infusion rate，GIR)一般从4～6 mg/(kg·min)开始。调节GIR，使血糖恢复到基础值±0.5 mmol/L。当连续3次血糖值基本位于平台时，即所谓“钳夹形成”。全部实验每5 min采血一次监测血糖，共持续120 min。

1.2.3 钳夹评价 将实验第60～120min的13个GIR求平均值,即GIR60-120mg/(kg·min),作为反映体内Ins敏感性的指标(GIR60-120越低，IR越严重)。

1.3 OXA干预实验 普通饲料或高脂饲料喂养大鼠6周后，进行OXA干预。NC组分为4组(每组各5只)，即NC0、NC1、NC2、NC3，均皮下注射OXA，浓度分别为0M、10-8M、10-7M、10-6M；HF组分为4组，即HF0(14只)、HF1(14只)、HF2(14只)、HF3(13只)，均皮下注射OXA，浓度分别为0 M、10-8M、10-7M、10-6M。连续7 d给药。7 d后处死大鼠，提取血标本，静置5 min，2 000 r/min离心20 min，留取上清，-20 ℃冻存待测。

1.4 脂代谢生化指标及胰岛素的检测 胆固醇(TC)测定：胆固醇氧化酶法。甘油三酯(TG)测定：甘油磷酸氧化酶法。高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)测定：酶法检测。以上由全自动生化分析仪检测。胰岛素：化学发光免疫分析法检测。

1.5 检测大鼠血清IGF-1和OXA 大鼠血清IGF-1和OXA检测分别用ELISA试剂盒；OXA-ELISA试剂盒由美国Phoenix公司生产；IGF-1-ELISA试剂盒由美国SLEMENS公司生产。

2 结 果

2.1 高脂膳食诱导IR肥胖大鼠的IR评价 实验前所有大鼠的体重无明显差别，按上述方法喂养6周后，NC组体重为(528.43±20.20)g，HF组体重为(550.32±35.45)g，二者差异有统计学意义，P<0.05。大鼠喂养6周后，从NC组及HF组分别随机抽取6只及17只大鼠行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验。结果显示，NC组GIR60-120为(30.22±2.76)mg/(kg·min)，HF组GIR60-120为(16.31±1.54)mg/(kg·min)，二者比较，差异有统计学意义，P<0.05。

2.2 OXA影响IR肥胖大鼠脂代谢及IGF-1 普通饮食或高脂饮食喂养大鼠6周后，NC组和HF组大鼠皮下注射OXA，随着血清OXA水平的升高，两组大鼠的胰岛素、TC、TG、LDL-C均明显升高(P<0.05)，HDL-C明显降低(P<0.05)。注射OXA(10-8M、10-7M、10-6M)，NC组大鼠的血清IGF-1分别降低25.0%、43.5%、55.6%，HF组大鼠血清IGF-1分别降低11.3%、17.7%、27.4%。见表1。

表1 OXA对IR肥胖大鼠IGF-1和脂代谢的影响±s)

注：与普通饮食组比较，*P<0.05。

2.3 IR肥胖大鼠血清OXA与IGF-1、脂代谢的相关性分析 普通饮食或高脂饮食喂养大鼠6周后，NC组和HF组大鼠皮下注射OXA。结果表明，随着血清OXA水平的升高，IR肥胖大鼠血清OXA水平变化与IGF-1、HDL-C呈负相关，相关系数r分别为-0.342、-0.226，P<0.05，差异均有统计学意义；与胰岛素、TC、TG、LDL-C呈正相关，相关系数r分别为0.303、0.388、0.255、0.253，P<0.05，差异均有统计学意义。

3 讨 论

胰岛素抵抗(IR)是正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，是指胰岛素的靶组织或靶器官对内源性或外源性胰岛素的敏感性下降，从而代偿性地引起胰岛β细胞分泌胰岛素增加。

判断大鼠IR模型制作成功的金标准是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术检测[4]。本实验结果显示，NC组与HF组大鼠平均葡萄糖输注率存在明显差别，提示高脂饮食诱导大鼠产生IR。本实验将体重无差别的大鼠给予普通饮食和高脂饮食6周后，高脂饮食组大鼠的体重明显高于普通饮食组，提示长期高脂饮食可增加体内脂肪堆积。

有研究证实，IGF-1可直接增加脂肪分解代谢及胰岛素敏感性，参与2型糖尿病与IR的发生[5]。研究显示，胰岛素对IGF-1水平起着重要的调节作用，影响IGF-1的活性，同时干预肝细胞生长激素受体活性，而IR可影响生长激素受体功能，从而引起生长激素依赖的IGF-1合成减少，血清内IGF-1水平的下降也可使机体过度分泌胰岛素，使IR抵抗进一步加重。有研究发现，肥胖患者血清IGFBP3增高、IGF-1水平降低，提示IGF-1及其受体在脂代谢中可能起重要作用[6]。本实验结果显示，IGF-1与胰岛素、TC、TG、LDL-C呈负相关，与HDL-C呈正相关，与上述研究结果一致。

Nowak等[7]发现，OXA刺激体内和体外胰岛素呈剂量依赖方式释放，皮下注射OXA能升高血糖和胰岛素水平。OXA引起的胰岛素分泌的变化，将通过胰岛素降低血糖并引起进食的作用促进摄食的增加，还通过胰岛素对脂肪的同化作用直接导致肥胖和IR的发生和进展[8]。有研究发现[9]，高脂饮食诱导的营养性肥胖大鼠血清胰岛素、TC和TG的水平明显高于对照组，但其体内下丘脑中orexin的基因表达却较对照组明显减弱，提示能量代谢的异常可以调节下丘脑的功能，机体可能通过对orexin基因表达的调节来干预体内的脂类代谢。本研究将实验大鼠分别注射不同浓度的OXA后观察胰岛素、TC、TG、LDL-C、HDL-C、IGF-1的变化。结果显示，注射OXA组与未注射组相比，胰岛素、TC、TG、LDL-C、HDL-C、IGF-1均存在明显差异，随着血清OXA浓度的增加，胰岛素、TC、TG、LDL-C均明显升高，HDL-C、IGF-1明显降低，提示OXA、

IGF-1及脂代谢三者密切相关，IGF-1可能在OXA所致IR的发生发展中起到重要作用。因此推测，在IR机体内OXA和IGF-1的改变用来逆转导致IR的炎症因子及脂肪因子的表达，从而发挥胰岛素增敏作用，但具体作用机制有待进一步研究。

[1] Ohnogi H，Hayami S，Kudo Y，et al.Angelica keiskei extract improves insulin resistance and hypertriglyceridemia in rats fed a high-fructose drink[J].Biosci Biotechnol Biochem，2012，76(5)：928-932.

[2] Gurbulak S，Yaylali GF，Yerlikaya E，et al.Resistin and leptin levels in acromegaly：lack of correlation with echocardiographic findings[J].J Investig Med，2013，61(3)：582-585.

[3] Grundy SM，Brewer HB Jr，Cleeman JI，et al.Definition of metabolic syndrome：report of the National Heart，Lung，and Blood Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to definition[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(2)：e13-e18.

[4] Seheen AJ，Paquot N，Casfillo MJ，et al.How to measure insulin action in vivo[J].Diabetes Metab Rev，1994，10(2):151-188.

[5] Luo J，Sobkiw CL，Hirshman MF，et al.Loss of class IA PI3K signaling in muscle leads to impaired muscle growth，insulin response，and hyperlipidemia[J].Cell Metab，2006，3(5)：355-366.

[6] Street ME，Smerieri A，Montanini L，et al.Interactions among pro-inflammatory cytokines，IGF system and thyroid function in pre-pubertal obese subjects[J].J Biol Regul Homeost Agents，2013，27(1)：259-266.

[7] Nowak KW，Strowski MZ，Switonska MM，et al.Evidence that orexins A and B stimulate insulin secretion from rat pancreatic islets via both receptor subtypes[J].Int J Mol Med,2005,15(6)：969-972.

[8] Johansson A，Fredriksson R，Winnergren S，et al.The relative impact of chronic food restriction and acute food deprivation on plasma hormone levels and hypothalamic neuropeptide expression[J].Peptides，2008，29(9)：1588-1595.

[9] 赵玉红，吴丽霞，关心，等.营养性肥胖大鼠的脂代谢紊乱与下丘脑中增食欲素A的表达分析[J].中国病理生理杂志，2011，27(5)：1000-1002.