肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染病原和分子诊断

高正琴，贺争鸣，关伟鸿

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)是一种自生和寄生世代交替的兼性寄生虫，也是一种机会致病性肠道线虫。机体感染后，成虫寄生于消化道，当宿主免疫力正常时，该虫经自身感染方式造成长期寄生可达数十年之久而不表现明显致病症状，但当宿主免疫功能低下时，幼虫可侵入肺、肝、脑、肾等器官，引起粪类圆线虫病(strongyloidiasis)，甚至死亡[1-4]。至今尚未见肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染的报道。本文首次对肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染进行了病原和分子诊断。现报告如下。

1 材料和方法

1.1 样本来源

肿瘤移植裸鼠(不明原因突发死亡)来自中国某药物研究机构。

1.2 病原诊断

将肿瘤移植裸鼠剖检发现：结肠水肿，收集水肿液多达2 mL。肉眼可见空肠内有数条细小线虫在内容物中蜿蜒游动。取结肠水肿液、空肠内容物涂片，实时动态显微视频摄录结果。

1.3 二重PCR分子诊断

针对粪类圆线虫act-2和btub基因设计引物。SSact-2F：5′-GATTATCGTAGTGAGAGGACGTGTAG AGATAATAAA-3′；SSact-2R：5′-CGGCAACCTCTTC GTCACACATTTTCTATAGCAAGT-3′；片段长度1183 bp。SSbtubF：5′-ATGAGAGAAATTGTTCACGTCCAA ACCGGCCAATGT-3′；SSbtubR:5′-TTTTTTTTTTTTT TTTTTGCAAGATAATAGTTTAAT-3′；片段长度1460 bp。收集肿瘤移植裸鼠结肠水肿液、空肠内容物中粪类圆线虫，用德国Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，按说明书操作抽提DNA。以抽提的DNA为模板，同时用刚地弓形虫、贾第鞭毛虫、蠕形住肠线虫DNA作为粪类圆线虫二重PCR扩增时的阴性对照。PCR总反应体系为50 μL，包括10×Buffer (Mg2+ Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(20 pmol/μL)各1.0 μL、EX Taq(5U/μL)0.5 μL、模板DNA 1 μL、nuclease-free water 37.5 μL。循环参数：95℃ 1 min 1；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 7 min 1个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

2 结果

2.1 病原学诊断结果

2.1.1 肿瘤移植裸鼠结肠水肿液涂片镜检结果：采集肿瘤移植裸鼠结肠水肿液低速离心，取适量沉淀用生理盐水直接涂片，实时动态显微视频摄录结果：可见数条异常活跃、呈蛇形浮游的线虫幼虫，呈C型或反S型，虫体外观无色透明，头端钝圆，尾部尖细，长约0.3 mm，具有双球型咽管(图1)。依据虫体形态，鉴定为粪类圆线虫杆状蚴[5-6]。

图1 肿瘤移植裸鼠结肠水肿液中粪类圆线虫杆状蚴

2.1.2 肿瘤移植裸鼠空肠内容物涂片镜检结果：取肿瘤移植裸鼠空肠内容物，用生理盐水直接涂片，实时动态显微视频摄录结果：可见大量无色透明、运动活泼、呈蛇形游走样线虫虫体，长约2.2 mm，宽0.03 mm，虫体半透明，体表具细横纹，口腔短，咽管细长，约为体长的1/3(图2)，尾端尖细，末端略呈锥形，生殖器官为双管型，肛门位于距尾端1/3处的腹面(图3)。依据虫体形态，鉴定为粪类圆线虫寄生世代雌虫[5-6]。

图2 肿瘤移植裸鼠空肠内容物中粪类圆线虫寄生世代雌虫头端

图3 肿瘤移植裸鼠空肠内容物中粪类圆线虫寄生世代雌虫尾端

2.2 分子生物学诊断结果

在粪类圆线虫感染肿瘤移植裸鼠结肠水肿液、空肠内容物样本中均检测出粪类圆线虫act-2和btub基因特异性DNA片段(大小分别为1183 bp和1460 bp)，而作为阴性对照的刚地弓形虫、贾第鞭毛虫、蠕形住肠线虫却未观察到目的基因片段扩增。肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫二重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图4。粪类圆线虫二重PCR扩增获得了清晰特异的act-2和btub目的条带，分子诊断结果确诊了肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染。

注：泳道1-2：粪类圆线虫感染裸鼠结肠水肿液样本act-2基因特异性PCR产物；泳道6-7：粪类圆线虫感染裸鼠空肠内容物样本btub基因特异性PCR产物；泳道3-5和泳道8-10：阴性对照：刚地弓形虫、贾第鞭毛虫、蠕形住肠线虫。

3 讨论

粪类圆线虫最先由Normand于1876年在越南境内一患腹泻法国士兵的粪便中发现，而后在尸检时又在肠道、胆管、胰管中发现许多线虫，但形态与粪便中的虫体不同。后经众多学者的不断研究后认为其为同一虫种的不同发育阶段，并对其生活史及侵入人体的途径和在人体内的移行有了进一步的研究。恶性肿瘤、器官移植、造血干细胞移植、HIV感染、使用皮质类固醇药物增加粪类圆线虫机会性感染的风险，未及时发现治疗者死亡率较高[7-12]。

本研究首次对肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染进行了病原和分子诊断。作者首先在肿瘤移植裸鼠结肠水肿液和和空肠内容物直接涂片中发现了粪类圆线虫的幼虫(杆状蚴)和成虫(雌虫)，此类报道实属罕见。首次应用实时动态显微视频摄录技术跟踪监测寄生虫，获得了粪类圆线虫幼虫和成虫典型特征形态及独特运动方式的宝贵视频资料。应用二重PCR技术，从分子水平上对肿瘤移植裸鼠感染的粪类圆线虫进行多基因特征确认，为快速准确鉴别诊断粪类圆线虫感染提供新的思路。

裸鼠先天性无胸腺，缺乏免疫反应，是免疫缺陷动物，类圆线虫病的发生可能没有任何症状。本研究中的肿瘤移植裸鼠，可能是因为肿瘤的移植加剧了免疫功能的受损，从而激发了潜在的粪类圆线虫自体加速传染扩散传播，也可能是因为移植了污染有粪类圆线虫的肿瘤而高度感染。因此，在肿瘤移植手术前期，一定要对供体肿瘤和受体裸鼠进行粪类圆线虫等病原体筛查检测，以保障质量和安全。

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