低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

雍曾花，徐宏燕，王大鹏，王晓英，姚合斌,

(1.安徽医科大学海军临床学院，北京 100048；2.解放军海军总医院基础医学研究中心，北京 100048；3.解放军海军总医院内分泌科，北京 100048)

低钾型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis，HypoPP)是一组以反复短暂发作性肌无力伴随血清钾降低为特征的常染色体显性遗传性离子通道疾病。其中，家族性低钾型周期性麻痹(familial hypokalemic periodic paralysis，FHypoPP)为最常见的形式，主要涉及的离子通道基因有CACNA1S、SCN4A和KCNE3 (分别编码骨骼肌电压门控L-型钙通道α1亚单位CaV1.1、钠通道α亚单位NaV1.4和钾通道辅助亚单位MiRP2)。HypoPP患者具有基因异质性，有研究报道HypoPP患者中CACNA1S基因突变最常见[1]。目前，HypoPP的发病机制尚不十分清楚。因受人体试验的伦理学限制，构建动物模型用于研究人类疾病已成为国际趋势。而99%的小鼠基因与人类基因组同源[2]，目前已成为研究哺乳动物尤其是人类基因功能的最常用且能够实现定点突变的模式生物[3]。因此，我们选择代表性好、发病症状重的CaV1.1 Arg528His(R528H)突变，运用同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)技术构建了Cchl1a3基因(与人类CACNA1S基因对应)R528H突变的HypoPP敲入小鼠模型，为在整体动物水平研究发病机制和病理生理提高良好的平台。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 打靶载体及实验动物

Cchlla3-knock-in打靶载体上海南方模式生物研究中心保存；SPF级C57BL/6J雌鼠，体重18～19 g，来自上海南方模式生物研究中心【SCXK(沪)2009-0023】。实验在上海南方模式生物研究中心屏障动物实验设施进行【SYXK(沪)2008-0035】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 细胞及培养基

来源于129S6/SV品系小鼠的ES细胞由上海南方模式生物研究中心保存。DMEM培养基、胎牛血清、G418、Ganciclovoir(均为Gibco BRL公司产品，美国)、LIF(Chemicon公司，美国)、青链霉素、胰蛋白酶(均为Sigma公司产品，美国)。

1.1.3 酶及试剂

Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega公司，美国)；Taq DNA聚合酶，dNTP及限制性内切酶(TaKaRa公司，日本)；PCR引物(上海英俊生物技术有限公司和上海生工生物工程有限公司合成)；琼脂糖粉(Oxoid公司，英国)；DNA Marker(深圳晶美生物技术有限公司)。

1.1.4 主要仪器

电转仪(Bio-Rad公司，美国)；显微注射平台(Olympus公司，日本)；PCR仪(Eppenddorf AG22331 Hamburg，德国)；DNA测序仪(ABI公司 Prism 377，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 Cchl1a3-knock-in打靶载体的构建

以Cchl1a3基因为模板设计引物，扩增套取同源臂并定向插入到pBR322质粒，并利用Red/ET介导的同源重组从含有Cchl1a3基因的细菌人工染色体中套取包含目的基因的片段。PCR扩增含有目的突变的同源臂并将其插入PL451质粒的Frt-neo-Frt片段两侧，再与携带Cchl1a3基因的pBR322- Cchl1a3质粒经同源重组后，在Cchl1a3基因片段内实现目的定点突变G→A，并插入neo筛选基因和Flp重组酶特异性识别位点Frt，从而获得Cchl1a3-knock-in打靶载体。该载体构建已在课题组的前期工作中完成[4]。

1.2.2 ES细胞的电转化及药物筛选

取处于对数生长期的ES细胞经0.125%胰蛋白酶-EDTA消化并计数，加适量的PBS使细胞密度达到约1.5×107/mL。取0.8 mL上述ES细胞悬液，加入约35 μg经Not I线性化的Cchl1a3-knock-in质粒DNA，混匀后以电压为240 V、电容为500 μF的电参数进行电穿孔，电转后的细胞重新悬浮后平均分配到3个已铺好滋养层细胞10 cm盘培养皿中培养。电穿孔24 h后换含有选择药物G418(300 mg/L)和Ganciclovoir(2 umol/L)的培养液进行选择性培养，每天更换培养液，8～10 d后可发现肉眼可见的抗性ES细胞克隆并进行挑取。

1.2.3 PCR法和DNA测序法鉴定同源重组ES细胞克隆

挑取的ES细胞克隆经消化、吹打后转移至96孔培养板中培养，部分冻存，部分用于提取基因组DNA。根据Cchlla3基因敲入载体构建策略(图1)设计特异性的PCR引物，进行PCR扩增筛选获得的ES细胞克隆是否发生双臂同源重组。其中，5’短臂上游引物P1为5’-TCACGCCACCCCTTCC ATGAACACA-3’(gene site: 39729-39753)，位于5’短臂外；下游引物P2为5’-CCTCCCCCGTGCCT TCCTTGAC-3’，位于neo重组区域，应扩增出2340 bp的片段。3’长臂上游引物P3为5’-CTGA GCCCAGAAAGCGAAGGA-3’，位于neo重组区域；下游引物P4为5’-CCCGTCCCCTTTTGGTGCAT AGTGC-3’ (gene site: 48770-48746)，位于3’长臂外，应扩增出7511 bp的片段。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。进一步对PCR产物进行DNA测序，明确有无突变。

1.2.4 ES细胞的囊胚注射及胚胎移植获得Cchl1a3基因R528H敲入嵌合小鼠并鉴定

囊胚来源于自然受孕并发育至囊胚阶段的C57BL/6J小鼠，将阳性ES细胞克隆显微注射到小鼠囊胚中，每枚囊胚中注射15个左右ES细胞。将注射后囊胚培养于无LIF的DMEM完全培养基中，37℃，5% CO2条件下培养1 h左右，再移植到2.5 d假孕母鼠子宫中，每侧移植8～10枚，自然分娩，产下的后代若毛色与ES细胞来源小鼠(129S6/SVEV灰褐色)相同，说明该鼠是有ES细胞整合的嵌合体小鼠。对该灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定(鉴定策略同上)，是否携带打靶后的突变基因。

1.2.5 Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠的获得及鉴定

再将嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配，获得杂合子小鼠并与携带Flp重组酶的FLP小鼠交配繁育，获得的子代小鼠可被位点特异性重组切除neo基因和1个Frt位点，为杂合的Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠。用PCR法鉴定子代小鼠是否发生去neo反应。根据Cchlla3基因敲入去neo小鼠基因组鉴定策略(图2)设计特异性的PCR引物。其中，5’短臂上游引物P1同上，下游引物P5为5’-TAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCC-3’，位于重组区域，产物大小为2116 bp；3‘长臂上游引物P6为5’-CCGGATCCACCTAATAACTTCGTAT-3’，位于重组区域，下游引物P4同上，产物大小为7165 bp。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。再对PCR产物行DNA序列测定进一步证实，其Cchlla3基因突变(G→A)和敲入的基因片段的重组位点是否正确。

图1 Cchl1a3基因R528H敲入载体的构建策略

图2 Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠基因组鉴定策略

1.2.6 繁殖获得Cchlla3基因R528H敲入去neo纯合小鼠及初步表型分析

Cchlla3基因R528H敲入去neo杂合子小鼠交配得到纯合的Cchlla3基因敲入去neo小鼠。然后对这些小鼠进行PCR及DNA测序进一步确定目的突变是否存在。Cchlla3基因敲入去neo纯合子小鼠PCR鉴定的上游引物P7为5’-CGCTTCGACTGCTTCGTGGTGTGC-3’，下游引物P8为5’-CCCGTGTTCATGCCAAAGCTGGGC-3’。纯合子小鼠应为870 bp的片段，而野生型小鼠应为748 bp的片段。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。再对PCR产物进行DNA测序进一步证实目的突变是否存在，并对该纯合子小鼠的外观、活动及生长发育等方面进行观察。

注：m：DNA marker；-：阴性对照；1-9：同源重组 ES细胞克隆。

2 结果

2.1 同源重组ES细胞克隆的筛选及鉴定

将线性化Cchl1a3-knock-in载体电转染到ES细胞中。经过G418和Ganciclovoir筛选培养8 d后发现并挑取96个药物抗性ES细胞克隆，提取其基因组DNA样本并进行PCR鉴定。结果显示有9个ES细胞克隆的5’短臂扩增产物长2.3 kb，3’长臂扩增产物长7.5 kb，提示双臂发生同源重组(图3)。因突变位点靠近5’短臂，进一步对这9个ES细胞克隆的5’短臂PCR产物进行DNA测序，结果验证目的突变位点正确，测序结果(图4)。

2.2 阳性ES克隆囊胚注射结果

通过显微囊胚注射共完成了250枚胚胎，并移植到2.5 d假孕母鼠子宫中，制作了13只受体。假孕母鼠饲养于上海南方模式生物研究中心SPF级动物房，自然分娩，产下15只小鼠。其中7只为嵌合度>50%的嵌合体雄性小鼠，它们的毛色呈灰褐色，与ES细胞来源的灰褐色129品系小鼠相同，也说明了外源的ES细胞已整合入生殖细胞，该嵌合体小鼠是种系嵌合体小鼠(彩插2图5)。

2.3 Cchl1a3基因R528H敲入去neo杂合小鼠的获得及鉴定

将嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得杂合子小鼠，再将该杂合子小鼠和FLP小鼠交配繁育，获得15只子代并对其进行PCR鉴定，结果显示其中9只小鼠(4雄，5雌)发生了去neo反应，即5’短臂扩增片段长度为目标的2.1 kb，3’长臂扩增片段长度为目标的7.2 kb。9只小鼠基因组DNA的PCR电泳结果(图6)。经DNA序列测定也证实了Cchlla3基因突变(G→A)和敲入的基因片段的重组位点是正确的。

2.4 纯合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠的获得及表型分析

将杂合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠交配，获得的子代小鼠中野生型、杂合子和纯合子的比例符合孟德尔遗传定律。对子代小鼠鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定，结果显示15只小鼠的基因组DNA扩增片段长度为870 bp，为纯合子Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠，而对照的野生型小鼠DNA扩增片段长度为748 bp(图7)。从这15只小鼠中随机抽取5只行DNA序列测定，结果也证实了该小鼠为携带Cchl1a3基因G→A突变的纯合子小鼠(彩插2图8)。纯合子小鼠发育至性成熟时精神、饮食及活动状态良好，但是在4个月龄时从背部开始出现脱毛和皮肤破溃，逐渐累及整个躯干，再延伸至头部及四肢，甚至出现死亡(彩插3图9)。

注：(a)箭头标记处为目的突变对应的反向突变位点C→T；(b)方框标记处为目的突变对应的反向突变位点C→T。

注：m：DNA marker；1，2，5，6，8，10，12，14，15：同源重组 ES细胞克隆。

注：m：DNA marker；-：野生型小鼠； 1-15：去neo基因纯合子小鼠。

3 讨论

Cchlla3基因编码小鼠骨骼肌L 型电压依赖型钙通道的a1亚基，与人类的CACNA1 S基因编码的氨基酸序列92%相同。在已发现的HypoPP突变位点中，人类和小鼠的氨基酸也完全相同，显示了它们在功能上的高度一致性。2008年，Hayward等[5]建立了表达SCN4A基因Met1592Val突变的小鼠，用于研究高血钾周期性麻痹(HyperKPP) 的模型。Wu等[6]又构建了SCN4A基因R669H突变敲入小鼠，用于研究HypoPP神经肌肉电生理的变化，也取得了一定的进展。HypoPP患者严重时可因呼吸肌麻痹或低血钾导致的恶心心律失常而危及生命。据Jurkat-Rott[7]报道，36个HypoPP家族中有15人死于本病发作，中位年龄仅22岁。鉴于这是一种危害严重的疾病, 建立与人类HypoPP具有相似遗传特征的点突变小鼠模型来研究该病的发病机制具有极高的价值。

在HypoPP患者已知突变中，CACNA1S基因R528H突变的地域分布最广，突变频率最高，具有代表性。因此，在前期工作中我们根据Liu[8]等和Chan[9]等人的方法，运用现在常用的Red/ET重组技术和Flp-FRT重组酶系统构建了Cchl1a3基因R528H突变打靶载体[4]。本研究基于neo(正选择标记基因)和HSV-tk(负选择标记基因)基因的正负筛选策略，通过ES细胞基因打靶获得9个同源重组克隆，PCR和DNA序列测定均证实Cchl1a3基因内实现R528H定点突变并插入筛选基因和重组酶特异性识别位点。同源重组ES细胞克隆经显微注射、嵌合体育种获得了低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H突变纯合子敲入小鼠模型，精确模拟CACNA1S基因第11号外显子上的R528H突变。本研究是国内首个成功构建的携带Cchl1a3基因R528H突变的敲入小鼠模型，不仅可以解决研究材料稀缺、代表性差的问题，还可以避免了在人体实验材料以及实验技术不可操作性的限制。

通过表型观察到去neo纯合子小鼠在性成熟前精神状态良好，饮食及活动与正常小鼠无差异，但在4个月龄时逐渐出现脱毛，皮肤破溃甚至死亡。经过加强环境消毒、垫料更换等处理，该纯合小鼠的皮肤状况没有明显改善，我们认为这可能与该小鼠残留有部分外源性基因有关。本研究中，杂合子小鼠与表达Flp重组酶的小鼠杂交后，携带的Frt-neo-Frt筛选基因片段被位点特异性重组切除neo基因和1个Frt位点，以减少对内源基因表达的影响。这是一种去除选择基因的有效方法，但仍在Cchl1a3基因11内含子中残留122 bp的外源性碱基。目前常用的基因敲入方法尚不能完全避免这种残留的重组靶点区[10-11]，但未涉及类似情况。本研究中，Frt-neo-Frt片段位于Cchl1a3基因11内含子中，而该内含子序列及残留序列经过网上比对发现并无编码功能，但也不能完全排除残留基因对转录后剪切加工的影响。此外，小鼠皮肤溃烂多因循环障碍和神经功能障碍导致，但是因该小鼠数量的限制，尚未对其进行肌肉电生理变化，或是血液指标等检测，我们还需进一步研究解释该现象。

HypoPP患者平时并不发病，而本研究的纯合子小鼠在没有预处理的情况下并没有出现肌肉麻痹、四肢瘫痪等HypoPP的典型表现，与该病患者相一致。目前，HypoPP只在统计学上与基因突变具有相关性，但关于相关基因突变的功能学研究甚少，突变导致低血钾的分子机制仍不十分清楚。HypoPP患者发病前常伴有明显的诱因，如剧烈活动、高碳水化合物饮食、酗洒、寒冷、劳累、上呼吸道感染、大量输入葡萄糖等。多数研究认为HypoPP患者的发作主要与胰岛素、甲状腺素、肾上腺素等内源性激素水平有关[12-15]。同时，在以往对HypoPP小鼠模型的研究中，只观察到突变小鼠在外源的低血钾环境下具有HypoPP发病时的肌肉电生理特征，但并没有出现自发性的低血钾。因该疾病需要在上述条件下诱发出现低血钾，本研究中并未对正常情况下的纯合小鼠进行血钾的检测，该部分数据有待进一步补充。此外，我们将在Cchlla3基因R528H突变敲入小鼠模型的基础上，给予各种激素处理并进行表型分析，以期证实该突变小鼠能够出现自发性低血钾等表现，精确模仿人类HypoPP的发病。这样不仅可以发现CACNA1S突变致HypoPP的分子机制，还可以在CACNA1S功能的基础研究上有新的突破，为改进防治措施和药物研发提供基础。

致谢 本实验得到海军总医院中心实验室周丽君研究员的悉心指导和技术帮助，对此表示感谢。

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