丹红注射液对Beagle犬的13周亚慢性毒性试验

迟福艳， 薛 云，戴学栋，马玉奎

(1.山东省临朐县人民医院，山东 262600；2.山东省药学科学院，济南 250033)

人们普遍认为中药的药性平和、不良反应小、安全可靠。但随着中药新品种及新剂型不断出现，特别是中药注射液的广泛应用，其不良反应也日益突出，渐渐引起人们的重视。中药注射剂成分往往复杂，所引起的不良反应也不能准确发现引起的机制。鉴于近年临床上中药注射剂引发的不良反应事故频发，为全面提高中药注射剂的安全性、有效性和质量可控性，SFDA下发了《关于开展中药注射剂安全性再评价工作的通知》(国食药监办〔2009〕28号)。按照SFDA的要求，我们在GLP条件下对丹红注射液进行了临床前安全性再评价研究。本试验通过观察13周重复静脉给予丹红注射液后Beagle犬所产生的毒性反应，预测临床用药中可能出现的不良反应，提示临床用药中需重点监测的指标，为临床用药的安全性提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

Beagle犬，合格证号：SCXK(京)2011-0003，雌雄各半，体重范围为(6～8)kg，由北京玛斯生物技术有限公司提供。饲养于普通级环境，室温(19～26)℃，湿度40%～70%，日温差≤4℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)20100004。

1.2 仪器与试剂

BS300型生化分析仪(深圳迈瑞公司制造)，用于血液生化学检测。C2000型血凝仪(北京东方普利生制造)，用于血液学检测。TCS-150型电子台秤(精确到0.01 kg，梅特勒-托利多仪器(常州)有限公司制造)，用于动物体重测定。TP1020生物组织脱水机、EG1160石蜡包埋机、RM2235切片机、DMLS2型显微镜(德国莱卡公司制造)，以上仪器用于组织病理学检查。

丹红注射液(浓缩液)由济南步长制药有限公司提供，每1 mL中含总黄酮以芦丁计为49.4 mg/mL(批号110511)；血液学检测试剂盒，由烟台卓越生物技术有限责任公司生产。血凝检测试剂盒由德国Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH生产。血液生化学检测试剂盒由迈瑞上海科华生物工程股份有限公司生产。

1.3 方法[1]

按照中药注射剂安全性再评价非临床研究评价技术原则要求，亚慢性毒性试验应采用啮齿类和非啮类两种动物；对于丹红注射液的大鼠亚慢性毒性研究已有报道[2]，但未见非啮齿类毒性研究，故本试验采用检疫合格的Beagle犬24只，雌雄各12只，按体重均衡原则分为4组，即溶剂对照组和丹红注射液3个不同剂量给药组(494，247，124 mg/kg)，给药容积为10 mL/kg，对照组同法给予10 mL/kg的生理盐水，每天1次给药，每周给药6 d，停药1 d，给药周期为13周，恢复期设为4周。

1.4 剂量设计依据[1]

中药、天然药物长期毒性试验技术指导原则中规定，长期毒性试验高剂量原则上使动物产生明显的毒性反应，低剂量原则上高于动物药效学试验的等效剂量、并不使动物出现毒性反应，结合毒性作用机制和模式在高剂量和低剂量之间设立中剂量，以考察毒性反应剂量-反应关系。

丹红注射液临床用药剂量以芦丁计为7.5 mg/kg，折算为犬的等效剂量为12 mg/kg。同时，Beagle犬急毒结果显示，667 mg/kg剂量给药后，Beagle犬出现呕吐、呼吸急促、后肢无力，活动减少等毒性反应，约(4～8) min恢复正常，445 mg/kg剂量给药后犬出现后肢无力和活动减少等毒性反应，约2 min恢复正常，296 mg/kg剂量给药后犬未出现任何毒性反应。参考急毒结果，按照技术指导原则要求，将494 mg/kg设计为亚慢性毒性试验的高剂量，此剂量为临床剂量的66倍，药效学等效剂量的41倍，124 mg/kg为低剂量，为临床用药剂量的16倍，药效学等效剂量的10倍。

2 结果

2.1 一般体征观察

高剂量组所有动物给药过程中均出现流涎和呕吐反应；中剂量组所有动物出现流涎，2只动物偶尔出现呕吐反应；低剂量组和溶剂对照组所有动物均未见任何异常反应。

2.2 体重变化

与溶剂对照组比较，494 mg/kg剂量组动物体重增长率明显偏低，在第1、2周出现统计学差异(P<0.05)，说明丹红注射液494 mg/kg剂量下可抑制Beagle犬体重增长；247 mg/kg和124 mg/kg剂量对Beagle犬体重无明显影响。见表1。

表1 丹红注射液对Beagle犬体重增长率的影响

2.3 血液学及血液生化学结果

参考本中心Beagle犬的背景数据及相关文献[3]，并与溶剂对照组比较，丹红注射液所有剂量组的血液学、心电等指标未见任何异常；TT、PT和TT明显延长，高剂量组动物血清中BUN和CR明显升高，出现统计学差异(P﹤0.05或P﹤0.01)；其它两个剂量组血液生化学指标基本在正常范围内。高剂量组动物血清中BUN和CR的升高停药4周后可恢复正常。给药结束时出现统计学意义的指标结果如表2所示。

表2 Beagle犬异常的血液学及血液生化学指标

2.4 病理组织学检查结果

丹红注射液高、中、低三个剂量组所有动物脏器重量均在正常范围内，各脏器未见肉眼可见病变。病理检查结果显示，494mg/kg剂量组50%动物肝脏枯否氏细胞增生，胞质内可见棕黄色颗粒；溶剂对照组及中、低剂量组所有动物所有脏器均未见药物相关性病理组织学病变(图1见彩插1)。

3 讨论

尿素氮(BUN)是人体蛋白质代谢的主要终末产物，肾脏为排泄尿素氮的主要器官；肌酐(CR)是肌酸和磷酸肌酸代谢的终产物，它的排泄量反映血液中的肌酸酐含量和肾小球的过滤速率，也就是肾脏的机能，当肾发生病变时，肌酐排泄受阻，血液中肌酸酐含量升高。通过测定血液中肌酐和尿素氮含量的测定，可检测肾功能是否异常[4，5]。本研究中，高剂量组Beagle犬血清中BUN和CR明显升高，表明丹红注射液494 mg/kg剂量下对肾脏功能有明显的损伤，病理学检查结果显示，未见明显的组织病理学病变，说明对肾脏的损伤仅仅是功能性损伤，并未有实质性病变。活血化瘀类药物可引起凝血时间延长，本试验中，犬血液的PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)和TT(凝血酶时间)明显延长，分析原因为丹红注射液具有活血化瘀作用，凝血时间的延长为丹红注射液的药效作用，无毒理学意义。病理学检查结果显示，高剂量组50%动物肝脏枯否氏细胞增生，胞质内可见棕黄色颗粒，分析原因为丹红注射液自静脉进入动物体内后，作为异物可能会激活肝脏的单核-巨噬细胞系统，使巨噬细胞增生，继而吞噬异物颗粒，直至清除。

Beagle犬亚慢性毒性试验可描述犬重复给予供试品后的毒性反应，是非临床安全性评价的重要内容，也是中药注射液再评价必须进行的研究项目。通过亚慢性毒性试验可以预测药物可能引起的临床不良反应的性质、程度、量效关系和时效关系、可逆性等；也可判断药物可能的毒性靶器官或组织，推测临床用药的安全范围，指导临床安全用药。本研究结果显示，丹红注射液静脉注射给药，其无毒反应剂量为124 mg/kg，其主要的中毒靶器官为肝

脏和肾脏等，提示临床应用中应密切监测患者以上器官的功能。

参考文献：

[1] 中药、天然药物长期毒性试验技术指导原则[S]. 国家食品药品监督管理局颁发, 2005, 3.

[2] 王保中, 曹茂荣, 邹薇红, 等. 丹红注射液毒理学研究[J].中国实用医药，2008, 3(11):27-29.

[3] 杨锋, 王红星, 何永亮, 等. 实验Beagle犬血液学及血液生物化学参考值的探讨[J]. 中国比较医学杂志, 2004, 14(6):355-358.

[4] 周宗灿. 毒理学教程[M]. 北京大学医学出版社, 2006: 425-427.

[6] 任丽, 蒋素华, 刘红, 等. 血肌酐水平、MDRD-GRF、CG-GRF与肾小管间质病变相关性研究[J].检验医学与临床, 2010,22(7):2436-2438.