嗜碱性粒细胞在胶原诱导性关节炎模型小鼠Th1/Th2应答失衡中的作用

陈秋华，唐 培，谢 彤，吴 平，兰巧芬，XIAO Hai-yan ，潘庆军

(1.广东医学院附属医院，广东，湛江 524001；2. Georgia Regents University, Cancer Center, Augusta, GA 30912, USA)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性关节炎症为主要特征的自身免疫性疾病，其临床表现和预后呈高度异质性，易反复发作，致残率较高，目前尚无较好的根治方法。RA发病机制虽尚未完全解析，但辅助性T细胞(Thl/Th2)应答失衡在RA发病中的重要作用已被广泛认知[1]。然而，导致RA患者Th1/Th2失衡的原因及机制尚不清楚，因此，深入研究RA发病中Th1/Th2失衡的原因及机制将有助于RA的防治。

嗜碱性粒细胞参与过敏反应已被熟知[2]，近年有关嗜碱性粒细胞在天然免疫、获得性免疫、免疫平衡调节等方面的研究取得了长足的进展和令人瞩目的成就。在免疫调节方面，嗜碱性粒细胞表面表达高水平的IgE受体FcεRI，通过与抗原特异IgE交联，或其他的活化途径，能产生Th2型细胞因子如IL-4和IL-13，介导Th0向Th2细胞分化[3，4]，而Th2型增强体液免疫应答。因此，嗜碱性粒细胞可通过增强Th2应答和削弱Th1应答而影响Th1/Th2平衡，进而参与多种自身免疫性疾病的发病过程，但至今，在RA方面研究极少。

胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)是最常用的类风湿性关节炎动物模型。由于其重复性好、易于界定、并被证实对类风湿性关节炎新疗法的发展有用而被广泛接受。

基于此，本文采用经典的胶原诱导性关节炎小鼠模型，探讨嗜碱性粒细胞在胶原诱导性关节炎小鼠模型Th1/Th2失衡中的作用。有望为RA的发病机制和临床防治提供线索。

1 材料和方法

1. 1 动物和实验材料

SPF级5～6周C57/BL6雄性小鼠，体重(15～18)g，购自广东省医学实验动物中心(粤监证字2008A055，合格证号0045725)， 饲养在广东医学院实验动物中心[SYXK(粤) 2010-0063]，25℃ 12 h 昼夜节律、55%湿度的饲养箱环境，喂养商品饲料和灭菌自来水。

牛II型胶原(Type II collagen)和弗氏完全和不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司。小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。红细胞裂解液、染色液、固定通透液、抗小鼠CD49B-FITC、IgE-PE抗体和APC-IL-4抗体购自美国Biolegend公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1. 2 方法

1. 2. 1 胶原诱导性关节炎小鼠模型的建立：依照参考文献[5]，将牛II型胶原(Type II collagen)溶解于0.05 mol/L冰醋酸中，浓度为2 g/L，将溶解的胶原与弗氏完全佐剂等体积混合，在冰浴中使用匀浆器充分乳化。模型组小鼠6只，对照组6只。免疫时，在小鼠背部和尾根部多点皮内注射0.1 mL乳剂(含100 mg 胶原和200 mg结核分支杆菌)。首次免疫后3周行第二次免疫，方法同第一次(佐剂换为弗氏不完全佐剂)，避开初次免疫部位，进行加强免疫。同时，对照组用CFA与0.05 mol/L冰醋酸等体积充分乳化后按上述方法进行免疫及21天加强免疫，制备胶原诱导性关节炎小鼠模型。

1.2.2 小鼠外周血和淋巴结组织采集和检测：分别在建模(初次免疫)前、建模后1周、3、6和9周眶静脉采血，肝素抗凝，并进行指标检测。同时进行关节肿胀的评分。

淋巴结细胞的制备参考[6]将C57/BL6小鼠断髓处死，无菌分离双侧颌下、腋窝、锁骨下、腹股沟浅表和肠系膜淋巴结，去掉被膜，于200目尼龙网筛研磨过滤，于4℃下200 r/min离心8 min收集细胞，4℃下PBS(0.05 mol/L, pH 7.2)洗涤2次，重悬后流式检测。

1. 2. 3 ELISA检测血清IFN-γ和IL-4：分别在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶静脉采血，300 r/min离心15 min，收集上清液，-20℃冻存，检测备用。用ELISA方法检测血清IL-4和IFN-γ水平。

1. 2. 4 流式细胞术检测外周嗜碱性粒细胞：分别在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶静脉采血，利用流式细胞术对外周血和淋巴结组织中嗜碱性粒细胞数量和表达IL-4的比例检测。具体为：取200 μL抗凝血，分别加入抗小鼠CD49B-FITC和IgE-PE抗体，室温孵育30 min，加入红细胞裂解液，室温避光15 min，300 r/min离心5 min，再用染色液重悬洗涤一次，再加入固定和透膜液10 min，离心去除固定和透膜液，染色液重悬后加入抗小鼠APC-IL-4抗体进行胞内染色15 min，加入染色液离心洗涤2次，最后将标记的细胞重悬200 μL染色液上流式检测，CD49b和IgE双阳性为嗜碱性粒细胞，再计算IL-4阳性的嗜碱性粒细胞占总嗜碱性粒细胞的比例。

1. 3 统计学方法

所有数据都采用SPSS 13.0分析，用均数±标准差表达。对照组和模型组检测指标比较使用两独立样本t检验(Independent Student’st-test)，P<0. 05认为差异有显著性。

2 结果

2. 1 胶原诱导性关节炎小鼠模型的建立

初次免疫后3周(既第21天)左右小鼠关节开始出现肿胀，起初为两后足红肿，逐渐延伸到前足和尾部，第42天左右肿胀达到最高，而后逐渐减轻。小鼠毛色、精神状态和粪便等在21 d前无显著变化，21 d后CIA组小鼠开始出现被毛松弛，行动迟缓，关节肿胀明显，少数小鼠可见局部足爪轻度溃疡(图1)。小鼠关节肿胀的评分见表1。

图1 对照组和CIA模型组小鼠后足初次免疫后第42天肿胀情况

2. 2 血清IFN-γ和IL-4的比值

CIA模型小鼠诱导早期，既初次免疫后1周和3周，血清IFN-γ/IL-4水平的比值显著低于对照组(图2)，提示Th2应答失衡。而CIA模型小鼠诱导中晚期，既初次免疫后6周和9周，血清IFN-γ/IL-4的比值显著高于对照组(图2)，提示以Th1应答为主。

图2 CIA模型组和对照组小鼠血清IFN-γ/IL-4水平的比值的变化情况(*，P <0.05；**，P <0.01)

2. 3 流式细胞术检测外周嗜碱性粒细胞数量和活化情况

CIA模型小鼠诱导早期，既初次免疫后1周和3周，外周嗜碱性粒细胞数量显著高于对照组(图3A)。而CIA模型小鼠诱导中晚期，既初次免疫后6周和9周，外周嗜碱性粒细胞IL-4阳性的百分比显著高于对照组(图3B)。

2. 4 流式细胞术检测淋巴结组织中嗜碱性粒细胞

CIA模型小鼠诱导早期，既初次免疫后1、3、6和9周，淋巴结组织中可检测到嗜碱性粒细胞，对照组小鼠则无(图4)。

表1 小鼠关节肿胀的评分

图3 CIA模型组和对照组小鼠外周血嗜碱性粒细胞数量和活化变化情况(*，P <0.05；**，P <0.01)

图4 流式检测CIA模型组和对照组小鼠淋巴结组织中嗜碱性粒细胞

3 讨论

RA患者Thl/Th2应答失衡模式的研究发现，Th1/Th2型细胞因子的产生在RA疾病的早期和晚期不同，提示在不同发病期可能存在Thl/Th2应答失衡模式的改变。在RA发病早期外周血单个核细胞中以Th2应答为主，而长期慢性RA则以Th1应答为主[1]。而且，在RA出现临床关节病变的最早期，在滑膜和滑膜液中呈现短暂的以Th2为主的细胞因子谱(IL-4和IL-13等)，而显著缺乏Th1型细胞因子(IFN-γ等)，这可决定早期滑膜炎发展成RA而不是非类风湿持久性滑膜炎[7]。在1例成年RA患者活动期滑膜中首先发现以Th2应答为主，而外周单个核细胞中以Th1应答为主，而后滑膜中发展为以Th0和Th1应答为主，且与RA炎症相关[8]。提示，在RA患者外周血和关节滑膜液中Th1/Th2应答失衡的模式，在不同病期可能会发生转换。

嗜碱性粒细胞通过IgE高亲和力受体FcεRl与IgE-抗原复合物交联，可诱导嗜碱性粒细胞活化进而释放炎性介质而介导组织损伤。RA患者高滴度的IgE抗体主要以免疫复合物形式存在[9]，在外周血和关节液中可检测到包含IgE抗体的循环免疫复合物(IgE-CIC)[10-12]，且IgE-CIC阳性的RA患者疾病活动度高于阴性的RA患者[13]，IgE-CIC可活化炎症效应细胞，如肥大细胞、中性粒细胞和单核细胞等[14,15]，促进RA疾病进展。瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)形成的免疫复合物可通过FcεRI受体交联活化RA患者嗜碱性粒细胞[16]。提示在RA中IgE型免疫复合物可能介导嗜碱性粒细胞活化，其介导的嗜碱性粒细胞的活化在RA发病中的作用有待进一步研究。

另外，本模型选用的是C57/BL6小鼠，在天然免疫中以Th1应答为主，而BALB/c则以Th2应答为主[17]，基于本项目中Th1/Th2应答与CIA模型诱导密切相关，而嗜碱性粒细胞是影响Th1/Th2应答，特别是Th2应答的关键细胞，故研究嗜碱性粒细胞在胶原诱导性关节炎模型小鼠Th1/Th2应答失衡中的作用时，要考虑C57/BL6小鼠和BALB/c不同背景的可能影响。

临床上关于RA患者嗜碱性细胞的研究报道比较少，一个以800例RA患者为主的研究发现，RA患者外周血嗜碱性粒细胞数量显著减少，且处于活化状态(以脱颗粒为活化标志)[18]。而另外一个以16例儿童RA患者为主的报道发现，幼年RA患者(juvenile rheumatoid arthritis, JRA)外周血嗜碱性粒细胞数量以增多为主(11/16)[19]。但目前，幼年类风湿性关节炎(JRA)现已更名为幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis, JIA)研究例数较少。另外根据临床经验，我们推测，可能与JRA患儿确诊时大部分处于发病的早期，而成年RA患者确诊时大部分处于发病的中晚期相关，有待进一步研究。

综上，嗜碱性粒细胞可能在CIA模型小鼠Th1/Th2应答失衡中发挥了作用，进而参与其发病过程。但CIA模型小鼠嗜碱性粒细胞活化和外周减少的机制，以及调控嗜碱性粒细胞数量和活化对CIA模型小鼠疾病进展的影响有待进一步深入研究，该研究有望为阐明RA发病机制和针对RA发病中Th1/Th2失衡的干预治疗提供新的线索。

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