多巴胺D1、D3受体敲除及双基因敲除对小鼠体重的影响

张 宝，刑 博，魏曙光，贾小妮，张洪波，李生斌

(西安交通大学医学部法医学院卫生部法医学重点实验室，环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西 西安 710061)

多巴胺是主要的儿茶酚胺类神经递质，它控制着运动、认知、摄食、内分泌调节等多种功能[1, 2]。在脑内，多巴胺主要通过多个神经环路系统发挥功能[3, 4-6]。环路之一即由下丘脑结节漏斗部投射到垂体，多巴胺通过与受体结合调控泌乳素的分泌[7]，从而参与调控机体的生长发育。作为G蛋白偶联受体超家族成员，多巴胺受体可分为D1样(D1和D3)和D2样(D2、D3和D4)两大类。研究发现多巴胺通过与受体结合对食物相关信号刺激、瘦素、生长激素释放肽及其它影响该系统活性的食欲相关调节因子产生应答。

多巴胺D1或D3受体的拮抗剂与其它D1样或D3样受体存在一定的选择性结合[8, 9]，很难区分不同受体的功能及它们间的相互作用。直至90年代出现敲除小鼠模型后，多巴胺D1、D3受体介导的许多行为特性才得以发现[10]。为深入的研究多巴胺受体介导的神经及生理活动，我校法医学实验室从芝加哥大学引进以C57BL/6为遗传背景的多巴胺D1受体敲除(D1-/-)小鼠和D3受体敲除(D3-/-)小鼠[8, 11]，并在这两系基因敲除小鼠基础上，繁育出多巴胺D1和D3受体双基因敲除(D1-/-D3-/-)小鼠。通过饲养繁育敲除小鼠，探讨D1-/-小鼠、D3-/-小鼠及D1-/-D3-/-小鼠与野生型在进食、饮水、体重增长等方面的差异，为利用基因敲除小鼠研究多巴胺D1、D3受体的功能及它们之间的相互作用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

引进及培育的D1-/-小鼠、D3-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠和野生型(WT)小鼠饲养于西安交通大学医学部实验动物中心按照无特异病原(specific pathogen free, SPF)级标准饲养。室内温度控制在18°C～22°C，湿度50%～60%。实验动物生产合格证号为：SCXK(陕)2012-003；实验动物使用合格证号为：SYXK(陕)2012-005

1.2 不同基因型小鼠进食、饮水、体重变化的比较

1.2.1 不同基因型小鼠进食、饮水情况比较：选取D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-与WT四种基因型雄鼠各7只，对其30 d、50 d、70 d 小鼠早晨10点通过电子天平称量前后2d的食物量及饮水量差别，对24 h内的进食量和饮水量进行测量，数据精确到0.01 g。

1.2.2 不同基因型小鼠体重比较：对以上选取的D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-与WT四种基因型雄鼠早晨10点对21 d(断乳时)、35 d、60 d、90 d的小鼠通过电子天平称量前后体重差别，进行比较，数据精确到0.01 g。

1.2.3 统计分析：分析各基因型小鼠间的统计学差异和各时间点敲除鼠与对照组的差别，采用单因素方差分析 (one-way analysis of variance，ANOVA)，通过Student-Newman-Keuls检验，进行两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 不同日龄D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-与WT小鼠进食量比较

如图1所示，不同基因型小鼠进食量统计分析发现：30 d时D1-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠、D3-/-小鼠均比WT小鼠进食量低，且D1-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠较WT小鼠差异有显著性(D1-/-vs. WT：**P<0.001； D1-/-D3-/-vs. WT：##P<0.001)，D3-/-小鼠和WT小鼠相比进食量无统计学差异；50 d所有基因型进食量均无统计学差异；70 d时D3-/-小鼠进食量显著高于WT小鼠(D3-/-vs WT：&&P<0.001)，其他组间差异无显著性。

在30 d和50 d之间D1-/-小鼠进食量呈明显上升趋势，且D1-/-D3-/-小鼠进食量介于D1-/-小鼠和D3-/-小鼠之间；在50 d和70 d之间D3-/-小鼠进食量有一个显著上升趋势；WT小鼠在此阶段进食量呈下降趋势。

图1 各基因型小鼠在不同日龄24 h进食。

2.2 不同日龄D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-与WT小鼠饮水量比较

如图2所示，不同基因型小鼠饮水量统计分析发现：与WT小鼠相比，D1-/-小鼠和D1-/-D3-/-小鼠在30 d(D1-/-vs WT：**P<0.001；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.001)、50 d(D1-/-vs WT：**P<0.001；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.01)以及70 d(D1-/-vs WT：**P<0.01；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.001)饮水量均显著性较低，30 d至50 d逐渐增长，50 d饮水量达到最高，之后下降；D3-/-小鼠在30 d至50 d之间饮水量与WT小鼠一样呈下降趋势，与WT小鼠不同的是，50 d至70 d之间WT小鼠饮水量依旧呈下降趋势，而D3-/-小鼠呈上升趋势，且在70 d明显高于WT小鼠(D3-/-vs WT：&&P<0.001)。

图2 各基因型小鼠在不同日龄24 h饮水量。

2.3 D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-与WT小鼠不同日龄阶段体重增长比较

如图3所示，不同基因型小鼠体重增长统计分析发现：四种基因型小鼠在90 d前体重曲线均呈现上升趋势。21 d，三种基因缺陷小鼠与WT小鼠相比体重较小，且均有显著性差异(D1-/-vs. WT：**P<0.001；D3-/-vs. WT：&&P<0.01；D1-/-D3-/-vs. WT：##P<0.001)；21 d至35 d，D3-/-小鼠和D1-/-D3-/-小鼠体重急剧上升；D3-/-小鼠除21 d外，其它时间点均与WT体重无差别；D1-/-D3-/-小鼠在60 d以后与WT小鼠体重无统计学差异；而D1-/-小鼠直至90 d体重才与WT小鼠无统计学差异；90 d 时，各基因型小鼠体重间无统计学差异。

3 讨论

人类几乎所有的疾病都与基因有关，基因敲除动物模型的建立，为研究人类疾病提供了一个崭新方法，尤其是遗传性疾病[12]。应用小鼠来复制动物模型是最经济最理想的[13]，本研究引进并繁育D1-/-和D3-/-小鼠后，培育出D1-/-D3-/-小鼠，完全按照SPF级动物饲养标准进行，为研究多巴胺受体介导的神经及生理活动制作本动物模型。同以往研究结果相同，繁育的小鼠后代基因型分布基本符合孟德尔定律[8, 11]。

大量研究发现，下丘脑在摄食行为、内分泌调节和生理特性改变方面起到了关键的调节作用[14]，多巴胺通路会对食物适口性、食物相关性信号刺激、瘦素、生长激素释放肽及其它影响该系统活性的食欲相关调节因子产生应答[15-18]。提示大脑多巴胺系统在食物的摄取过程中发挥重要作用[19-21]。通过与受体相结合，多巴胺发挥生物学作用。本研究发现，各类型缺陷小鼠断乳体重均显著低于WT小鼠，而后呈上升趋势，35 d时D3-/-与WT小鼠体重无统计学差异；D1-/-D3-/-小鼠体重在60 d时与WT小鼠趋于一致，而D1-/-小鼠体重直到90 d时与WT小鼠趋于一致。该实验结果提示：多巴胺通过D1、D3受体发挥相关作用，对小鼠断乳和35 d体重增长有一个较为显著的影响，可能由于哺乳期多巴胺D1、D3受体直接或间接地对母鼠的泌乳产生影响，导致仔鼠断乳体重较小，断乳后进食量显著上升，体重随之呈代偿性增加[7]。

本研究中，D1、D3受体基因敲除后，通过影响多巴胺的生物学效应，进而影响仔鼠断乳体重。近年来，文献报道母犬舔舐子犬或饲喂子犬时，纹状核多巴胺大量释放；个体纹状核多巴胺的释放水平与母犬舔舐和饲喂行为显著相关[ 22, 23]。同时研究报道，纹状核损伤或注射多巴胺受体拮抗剂可影响泌乳等母性行为[ 24, 25]。因此，本文中，多巴胺D1，D3受体敲除对小鼠体重的影响可能有两方面因素，一是受体敲除后，通过多巴胺而调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的活性，从而调控仔鼠的觅食与饱腹感，最终影响仔鼠初生重及泌乳期体重。二是多巴胺D1、D3受体基因的敲除可能通过干扰多巴胺活性调控泌乳等母性行为，进而影响小鼠的体重。多巴胺D1、D3受体如何影响小鼠泌乳导致体重增长变化的具体分子生物学机制，有待于进一步深入研究。

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