肠道嗜性和神经嗜性SIV毒株Gp120序列变异特点的比对分析

徐 珮，丛 喆，陈 霆，王 卫，薛 婧，骆 杨，吴小闲，魏 强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

猴免疫缺陷病毒(SIV)在恒河猴体内由于个体的免疫差异不同会形成具有不同组织嗜性的SIV准种，如肠道嗜性和神经嗜性病毒等。SIV的包膜区包含了主要的与细胞嗜性和细胞毒性等相关的基因序列，其中Gp120蛋白在病毒与靶细胞之间的结合感染过程中起到关键的作用[1]，因此了解不同嗜性病毒准种的包膜Gp120蛋白序列之间的差异特点，将对SIV感染形成AIDS相关肠病和脑病的分子机制研究起到重大推进作用。

本实验在实验室前期工作基础上从四只接种SIVmac239单克隆毒株的晚期发病恒河猴外周血淋巴细胞中分离病毒，比对了一个单克隆毒株在不同猴体内的进化变异情况。同时对比分析肠病嗜性和神经嗜性病毒Gp120蛋白的氨基酸序列以及N-糖基化位点变化，以期通过发现有义的的序列变异位点，为AIDS相关肠病和脑病的基础研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 病毒

4只中国恒河猴RM-391、RM-372、RM-409、RM-411直肠感染SIVmac239-P12一年后发病，外周血CD4+T细胞绝对数长期减少至200个/μL以下，分离4只猴外周血淋巴细胞，并与正常猴淋巴细胞共培养，扩增制备病毒，分别命名为SIVmac239-RM391、SIVmac239-RM372、SIVmac239-RM409和 SIVmac239-RM411。其中SIVmac239-RM391感染猴后可以在短期内引起实验猴急性亚急性胃肠道症状，严重腹泻甚至死亡，是一株典型的艾滋病肠病病毒(数据未显示)。

分离自SIVmac251感染晚期恒河猴大脑基底节的SIVmac251-155p6N感染恒河猴后出现明显的脑神经病理现象和中枢神经系统病变[2]，本研究从感染猴R21755脑脊液和基底节中分离到两株病毒，分别命名为SIVmac251-THC-2-CSF和SIVmac251-THC-2-J。

1.2 有限稀释法分离病毒单克隆毒株[3]

将待分离的病毒准种用10%牛血清1640生长液10倍稀释，稀释8个滴度，将稀释好的病毒加入96孔板中，每个滴度12个复孔，每孔100 μL。将生长状态良好的CEMx174细胞(1×105个/孔)100 μL加入96孔板。37℃ 5% CO2培养箱培养。4～6 d后可在显微镜下看到一些稀释度的细胞出现形态变化：多个细胞融合，核膜消失，形成大的空泡。选取出现融合泡少于四个孔的稀释度(阳性率小于30%认为是单克隆)，将这些阳性孔中细胞和上清转出并添加正常细胞继续扩大培养。病变程度达到++++时，收集细胞培养上清分装冻存。

1.3 RT-PCR扩增及病毒env基因序列变异分析[2]

提取病毒RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA，Cat No. 6110A)反转录成cDNA，使用高保真酶Kod-plus (东洋纺公司，Cat No. kod-201)进行单拷贝PCR扩增env基因中长约1.6 kb 的片段，对基因序列做变异比对分析。序列经Vector NTI Suite 8软件编辑校正后，使用BioEdit Sequence Alignment Editor软件进行比对，MEGA4软件作图。美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库网站提供标准序列及糖基化位点分析http://www.hiv.lanl.gov/。

2 结果

2.1 有限稀释法分离病毒单克隆毒株结果

有限稀释法分离的所有病毒单克隆毒株，提取病毒RNA后通过逆转录PCR比对分析env基因序列变异情况，共得到50株单克隆病毒的env序列(表1)。其中外周血来源的病毒准种所含单克隆较多，脑组织来源的病毒准种的单克隆比较少。

表1 有限稀释法分离病毒单克隆毒株结果

图1 SIVmac239-P12感染猴来源病毒 gp120基因的系统进化树分析

2.2 SIVmac239-P12感染猴来源的病毒 gp120基因的系统进化树分析

系统进化树表示病毒毒株之间的进化关系。通过系统进化树对4只感染猴来源的单克隆的gp120基因进行分簇，结果表明SIVmac239毒株在不同猴体内发生了不同程度的变异进化，来源于同一只猴的病毒单克隆之间差异不是很大，在进化分组上仍属于同一组。在4组准种之间，SIVmac239-RM-372，SIVmac239-RM-391 和SIVmac239-RM-409这三组的序列较相近，SIVmac239-RM-411出现了较不同的变异，基因距离与其他三组较大(图1)。

2.3 肠道症状感染猴与神经症状感染猴来源毒株Gp120氨基酸序列的比对

SIVmac239-RM-391 和SIVmac251-THC-2来源的单克隆序列比对结果显示(图2)，肠病毒株与脑病毒株其Gp120氨基酸序列在其保守区和可变区均有差异，位于可变区的差异位点较多。这两种来源毒株序列的差别主要集中在V1和V4区，脑病毒株在V1区和V4区出现了氨基酸位点的连续改变TPPT-AKA-STKSI(V1)和DMRD-TE-R(V4)。在V3区，分离毒株与SIV mac239标准序列有六处个氨基酸位点有差异，但两种嗜性的毒株之间差异较小，在312位点，肠道嗜性毒株中14个为赖氨酸(K)，1个是精氨酸(R)；神经嗜性毒株中4个是精氨酸(R)，2个是赖氨酸(K)。337位点神经嗜性毒株都是缬氨酸(V)，而肠道嗜性毒株只有一个是(V)，其余都是异亮氨酸(I)。

注：391系列为肠道嗜性毒株，CSF和J系列为神经嗜性毒株

2.4 肠道嗜性和神经嗜性SIV毒株Gp120区糖基化位点预测

使用美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库网站在线工具对肠道嗜性和神经嗜性病毒单克隆Gp120区进行N-糖基化位点(N-X-S/N-X-T)的预测。预测结果显示SIVmac239-RM-391和SIVmac251-THC-2毒株出现了糖基化位点的缺失和增多现象。对比SIVmac239标准序列，两组嗜性毒株在V3区317位点(K-N)均有一个糖基化位点的增加。SIVmac239-RM-391来源的毒株在V4区有一个的糖基化位点的增加(419A-T)。在417位点SIVmac239标准序列为丙氨酸A，肠道嗜性为苏氨酸T，神经嗜性为精氨酸R。神经嗜性毒株其糖基化位点的变化则出现在保守的C1、C2、C3区，在C1和C3区出现了糖基化位点的缺失(79N-D，373N-H/P)，C2区有一个糖基化位点的增加(256K-N)(图3)。

3 讨论

研究表明，在HIV自身的高变异特性上，HIV在体内受到宿主免疫压力的作用会产生一种连续的定向的突变趋势以获得有效的突变株，从而在宿主体内存活繁殖。而在这些有效的突变毒株中，有一些毒株对宿主的组织器官的会产生不同的致病能力，即产生了不同的细胞嗜性和毒性的突变株。在早期的HIV基因组分子研究中，已明确了病毒包膜区对病毒的感染和复制的重要性[1]。包膜糖蛋白Gp120对病毒的细胞嗜性和细胞毒性的影响更是受到了关注。本实验通过比对SIVmac239感染的四只恒河猴血浆分离病毒的Gp120序列，显示同一SIV毒株在不同猴体内会产生具有多元化的Gp120序列的病毒准种，从我们所比对分析的四组SIV单克隆的基因系统进化树结果来看，同一个体来源的单克隆也会有一定的差异，但从整体来看，四个来源的单克隆又分属于自己的小组，并没有出现明显的交叉变异现象，这一点证实了个体免疫压力差异会使SIV的变异产生一定的趋向性。

这种病毒变异的趋向性会形成一些特定毒株，可对宿主不同的器官组织产生致病性，现在已证实了一些肠道嗜性和神经嗜性等HIV病毒株的存在[4.5.6]。Toshiaki Kodama等人从同一猴子的肠道和脑内分离SIV，证实了这两种嗜性病毒变异株的独立进化性[7]。那么具有肠道嗜性和神经嗜性的SIV毒株都有哪些特性呢？SIV病毒在猴体内复制繁殖时，在体内复杂的免疫压力下，只有能够有效感染靶细胞，且能逃避中和抗原作用的病毒才能在体内建立稳定的复制。SIV包膜蛋白Gp120是病毒膜表面唯一暴露在外环境中的糖蛋白，它对细胞嗜性和细胞毒性的影响在艾滋病研究中受到广泛关注。Gp120按其可变性可分为5个保守区(C1～C5)和5个可变区(V1～V5)，5个保守区构成了Gp120的结构核心，CD4、趋化因子受体的结合位点和与gp41相互作用的主要位点等[8]。在病毒的嗜性形成中，氨基酸在这些区域的定向突变起到很大作用，同时突变引起包膜蛋白上的N-糖基化位点的糖基化程度和排列的变化也会调整包膜蛋白的构象，对病毒的宿主范围有重大影响[9]。

本实验肠道嗜性毒株和神经嗜性毒株的Gp120氨基酸序列结果显示，这两种嗜性毒株在V1和V4区具有较大差异。有研究表明，V1/V2区的某些特定氨基酸与小胶质细胞合胞体形成有关，V1区对病毒在巨噬细胞中进行有效复制具有重要作用，可以为可能出现神经嗜性毒株提供基础[10]。我们发现在神经嗜性的毒株V1和V4区出现的长且集中的氨基酸位点的突变，这种集中的变异并未在肠道嗜性毒株中观察到，而在蛋白二级结构预测中，只有V1区出现了一个β-片层的差别，故V1区的氨基酸巨大差异可能正是与神经嗜性形成相关的重要区域。在之前的研究中，V4区一直被推测为仅作为一种掩盖物来帮助病毒逃避机体免疫反应。我们的结果显示，V4区的氨基酸差异并没有造成蛋白二级结构的变化，但肠道嗜性的毒株在V4区417A-T的变异使得该区域有一个糖基化位点的增加。在SIVmac239 原始毒株和突变的神经嗜性毒株上此处没有糖基化位点，说明该糖基化的出现与肠道嗜性有一定的相关性。原始的SIVmac239 毒株可引起轻微的肠病症状，但391毒株可引起严重的肠道症状，所以该位点的A-T的变异造成糖基化位点的增加可能使SIV毒株的肠道嗜性增强。

先期的病毒嗜性研究中均认为V3区与病毒的嗜性高度相关[11]，许多结果表明，要影响病毒的细胞嗜性，一般至少需要3个以上的氨基酸发生改变，但在某些情况下，一个氨基酸的变化就会影响对一个细胞系的感染[12,13]。Takeuchi Y等人发现改变HIV-1的分离株，GUN毒株，V3区311位点脯氨酸为丝氨酸(P-S)就能使该毒株具备感染脑源性成纤维细胞的能力[14]。我们发现在V3区两种嗜性的毒株317位点都有一个N-糖基化位点的增加，两种嗜性的毒株虽然与SIV mac239原始毒株有六处氨基酸位点的变异，但其中3处变异两种嗜性毒株完全相同，其余变异位点也具有一定的相似性和交叉性。 所以虽然V3区的氨基酸变异和糖基化修饰与毒株的嗜性具有很大相关性，但并非是造成肠道嗜性和神经嗜性差异的重要区域。

Gp120的保守区和可变区多个区域均分布有N-糖基化位点，而糖基化的改变使DC-SIGN在病毒对巨噬细胞的附着中发生变化，从而建立巨噬细胞和小胶质细胞嗜性，导致神经毒性毒株的出现[15]。本研究中发现，神经嗜性病毒糖基化位点在C1和C3各出现了一个糖基化位点的缺失，而调控HIV对大脑毛细血管内皮细胞嗜性的序列定位恰恰就包括Env的C1区部分，该功能域被认为与巨噬细胞嗜性和T细胞嗜性相关，是病毒通过血管内皮细胞，突破血脑屏障进入中枢神经系统的关键。同时在刘克剑等人的研究中，也观察到脑病毒株在C1区的糖基化位点缺失现象[2]。本实验中神经嗜性毒株在C1区同样也出现糖基化位点的缺失，而在肠道嗜性和SIVmac239原始序列中均无该现象，进一步证实了C1区这一糖基化缺失与神经嗜性形成的相关性。而C2和C3区出现的糖基化位点变化，在Fiorella Rossi 等人的研究中提到了C2区糖蛋白对病毒嗜性的影响作用[16]但C3区目前没有提及，所以这两个区域糖基化位点的变化及其功能仍有待进一步的研究。这也提示我们，包膜蛋白保守区的变异可能与具有神经侵袭性和神经嗜性的猴免疫缺陷病毒的形成相关，需要引以重视。

综上所述，SIV病毒在体内的变异进化具有一定的趋向性，形成的肠道嗜性和神经嗜性毒株其包膜蛋白Gp120的序列具有显著差异。两种嗜性毒株Gp120氨基酸序列差异集中在V1和V4区，而V4区的糖基化位点增加可能与肠道嗜性的增强相关。神经嗜性毒株在保守区的糖基化位点变化值得注意，尤其是C1区的糖基化位点的缺失与神经嗜性的形成密切相关。V3区作为一个重点与毒株嗜性相关的区域，在本研究中发现它并非是造成肠道嗜性和神经嗜性差异的主要区域。提示我们在今后对病毒嗜性的研究中，不仅要关注Gp120可变区发生的较明显的氨基酸变化，也要重视在保守区的个别可引起糖基化修饰位点变化的氨基酸位点。这对今后在AIDS相关肠病和脑病分子基础研究中有一定的指导作用。

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