白藜芦醇对血管钙化大鼠血压和心脏功能的影响

刘国栋，刘秀华，白 静，李瑞生，王 禹

(1.中国人民解放军总医院心血管内科，北京 100853；2. 中国人民解放军第95577部队医院 云南 曲靖 655601；3.中国人民解放军总医院病理生理学研究室，北京 100853；4.中国人民解放军第302医院实验技术研究保障中心，北京 100039)

血管钙化是发生于大中动脉血管壁钙盐的过度沉积的异位钙化现象，是动脉粥样硬化、糖尿病、高血压病、慢性肾功能不全和衰老等多种疾病的共同病理生理基础，是心血管疾病的一个重要危险因子[1]。发生血管钙化的同时往往伴有管壁僵硬、顺应性降低、血压升高、左心室肥厚、心室功能减低等一系列并发症状。白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种非黄酮类多酚化合物，存在于葡萄科、百合科、豆科等多种植物中，在葡萄中的含量尤为丰富。法国人日常摄入大量脂肪，但心血管疾病的发病率与死亡率都明显低于欧洲其他国家的“法国悖论”现象，主要与其日常饮用葡萄酒相关[2]，白藜芦醇可能是其主要的功能因子。然而白藜芦醇对血管钙化大鼠的血压和心脏功能的影响研究尚未见报道，本实验拟利用维生素D3和尼古丁建立血管钙化模型，并在此基础上观察白藜芦醇对钙化大鼠血压、心脏功能、血管结构以及主动脉和血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性的影响,为今后研究心血管疾病的预防及治疗提供可靠的实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择32只SD大鼠，雄性，8周龄，单鼠体质量180 ～200 g，购于军事医学科学院实验动物中心，生产许可证[ SCXK(军)2012-0004 ]。动物实验在解放军第302医院SPF级动物实验设施内完成，实验动物使用许可证[ SYXK(军)2012-0010 ]。

1.2 主要试剂与器材

白藜芦醇和维生素D3购自Sigma公司；尼古丁为Sigma公司产品由北京大学医学部齐永芬教授馈赠；ALP测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；多通道生物信号采集处理系统(RM6240BD)为成都仪器厂生产。

1.3 大鼠钙化模型的制备

大鼠钙化模型的制备在Niederhoffer等[3-4]方法的基础上加以改进。大鼠适应性喂养1周后随机分为对照组(Con)、钙化组(Cal)、白藜芦醇低剂量处理组(Cal+Res[L])和高剂量处理组(Cal+Res[H])，每组各8只。(1)Con组上午8时给予等量生理盐水和单纯花生油灌胃；(2)Cal组：第1日上午8时维生素D3( 300 000 U/kg ) 肌肉注射加尼古丁( 25 mg/kg )溶于5 m L花生油灌胃，下午6时重复灌胃1次；(3)Cal+Res[L]组：在 Cal组的基础上，从第2日开始每天给予25 mg/( kg·d )的白藜芦醇灌胃；(4)Cal+Res[H]组：在 Cal组的基础上，从第2日开始每天给予50 mg/( kg·d )的白藜芦醇灌胃；除外Con组，其它三组大鼠第3周后末重复维生素D3肌注1次，各组动物均常规饲养6周后进行下述检测。

1.4 血压和心脏功能相关指标的测定

术前禁食过夜，自由饮水，称重，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。 参照王艳飞等[5]方法，固定后分离并暴露右侧颈总动脉，将肝素钠浸润的导管(PE-50)插入右颈总动脉经压力传感器与多通道生物信号采集处理系统相连，手术后稳定15 min，记录颈动脉波形，将导管继续向前推进，屏幕上接着出现振幅高大、波宽较大的室内压变化的波形，表示导管已经进入左心室。波形稳定后，记录左心室压力曲线，系统自带软件分析数据。测定完成后打开胸腔分离心脏，剪取左心室部分并称重。

1.5 血清和主动脉ALP 活性测定

腹主动脉采集全血，取2 mL，4℃，3 000 r/min离心15 min，收集上层血清。取约10 mg胸主动脉，以等渗PBS制备组织匀浆，4℃ 8 000 r/min离心10 min，吸取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白含量测定；按照ALP测定试剂盒说明书测定血清和主动脉ALP活性， 根据在波长405 nm处测定4-硝基酚的生成速率，计算出ALP的活性，其中主动脉ALP活性用蛋白含量进行标准化处理。

1.6 HE染色

取胸主动脉约1cm，用4%中性甲醛溶液固定，常规进行石蜡包埋、切片、HE染色和中性树胶封固，最后显微镜下观察。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

Cal组和白藜芦醇处理组大鼠从造模后第1天，出现嗜睡，震颤，厌食，1周后症状明显减轻。实验结束后，各组体重出现差异，与Con组比较，Cal组大鼠体重减轻6.9%(P<0.05)，与Cal组比较，Cal+Res[L]组和Cal+Res[H]组体重分别增加3.7%和5.0%(均P<0.05)。(表1)

2.2 血压和心功能指标分析

与Con组比较，Cal组大鼠的LVW/BW、HR、SAP、PP、MBP 和LVSP分别升高了27.3%(P<0.01)、8.8%(P<0.05)、22.8%(P<0.01)、47.5%(P<0.01)、13.6%(P<0.01)和19.0%(P<0.01)，Cal组大鼠的DAP、LVEDP和 ±LV dp/dtmax没有明显变化(均P>0.05)；与Cal组比较，Cal+Res[L]组的PP8.5%(P<0.05)，LVW/BW HR、SAP、DAP、MBP、LVSP、LVEDP和±LV dp/dtmax没有明显变化(均P>0.05)；与Cal组比较，Cal+Res[H]组的LVW/BW、SAP、PP、MBP和LVSP分别降低14.2%(P<0.05)、13.6%(P<0.01)、23.7%(P<0.01)、10.0%(P<0.01)和9.0%(P<0.01)，HR、DAP、LVEDP和 ±LV dp/dtmax没有明显变化(均P>0.05)；与Cal+Res[L]组比较，Cal+Res[H]组的SAP、PP和LVSP分别降低8.3%(P<0.05)、16.7%(P<0.01)和5.8%(P<0.05)，LVW/BW、HR、DAP、MBP、LVEDP和±LV dp/dtmax没有明显变化(均P>0.05)。(表1)

表1 大鼠体重、血压和心功能指标

2.3 血清和主动脉ALP活性的变化

与Con比较，Cal组大鼠血清和主动脉ALP活性分别增高280%和265%(均P<0.01)；与Cal组比较，Cal+Res[L]组血清和主动脉ALP活性分别降低34.5%和29.5%(均P<0.01)；与Cal组比较，Cal+Res[H]组血清和主动脉ALP活性分别降低53.1%和45.9%(均P<0.01)；与Cal+Res[L]组比较，Cal+Res[H]组血清和主动脉ALP活性分别降低28.4%和23.2%(均P<0.01)。(图1)

注：(n = 6)数据采用表示，与Con比较**P < 0.01，与Cal组比较，##P < 0.01，与Cal+Res[L]组比较，△△P<0.01。

2.4 主动脉HE染色结果

HE染色显示，与Con组比较，Cal组大鼠主动脉平滑肌细胞大量增殖，管壁厚度明显增加，弹力纤维排列紊乱。与Cal组大鼠比较，Cal+Res[L]组和Cal+Res[H]组大鼠主动脉平滑肌细胞增殖减少，管壁厚度减小，弹力纤维排列紊乱程度明显减轻，主动脉中膜纤维排列有序，层次分明，着色均匀 (图2，见文后彩插1)

3 讨论

血管钙化是许多心血管疾病的重要特征之一，根据钙化在血管壁发生的部位不同，血管钙化可分为内膜钙化和中膜钙化。内膜钙化主要发生于大血管和冠状动脉，与内膜增生和粥样斑块形成有关，促进了冠状动脉粥样硬化性疾病的进展。中膜钙化，即Monckeberg钙化，主要发生在糖尿病和慢性肾功能不全的患者，会导致管壁僵硬度增加，顺应性降低，冠脉血流灌注不足，左心室肥厚，最终发展为充血性心力衰竭。

大剂量的维生素D3可以使血管的弹力纤维降解，使体内的钙、磷沉积到血管组织，维生素D3还可以激活血管平滑肌细胞维生素D受体，促进细胞对钙的吸收，诱导成骨因子的表达[6]。尼古丁可以增强维生素D3的作用，两者合用可以引起动脉钙超载，引起中膜钙沉积，最终导致血管钙化。ALP是骨矿化过程中的关键酶，血管平滑肌细胞可在各种致钙化因素作用下ALP表达，且酶活性显著增加，血管钙化过程中，成骨细胞分泌ALP和钙晶体到细胞外基质，ALP能够提供底物促进羟磷灰石结晶生成和局部磷酸含量的升高，ALP可以促进血管平滑肌细胞钙化和磷的释放，通过降低ALP活性可以阻止血管钙化。本实验用大剂量的维生素D3和尼古丁建立了6周的血管钙化模型，结果发现Cal组大鼠血清和血管组织ALP活性较Con组明显升高，而白藜芦醇处理组大鼠血清和主动脉ALP活性较Cal组降低，表明白藜芦醇可能具有一定的预防血管钙化的作用[7]。

目前，我国已经步入老龄化社会，随着年龄的增长，高血压病患病率越来越高，而高血压病人较早出现的心脏结构改变是左心室肥厚。我们在诱导血管钙化的同时发现Cal组大鼠的LVW/BW、HR、SAP、PP、MBP和LVSP明显升高[8-9]，可能是由于血管钙化大鼠血管管壁僵硬度增加，顺应性降低并最终导致了血压升高和左心室的肥厚。与Cal组比较，Cal+Res[H]组的LVW/BW、SAP、PP、MBP和LVSP明显下降，说明白藜芦醇具有降低血压，逆转心室肥厚和改善心脏功能的作用。HE染色结果显示：与Cal组大鼠比较，白藜芦醇处理组抑制了钙化血管平滑肌细胞的增殖，减小了管壁厚度[10]，同时弹力纤维排列紊乱程度也明显减轻，与血流动力学指标变化相一致。

血管内皮细胞在调节血管收缩和舒张过程中起着重要作用，血管内皮细胞通过释放血管活性多肽(ET)收缩血管并促进内皮细胞增殖，同时释放一氧化氮(NO)舒张血管并抑制内皮细胞增殖。生理条件下，ET与NO处于动态平衡，使血管张力保持正常，病理条件下，ET与NO动态平衡被打破，白藜芦醇的降压作用的机制可能是由于其具有调节ET与NO两者生成，并增强NO的活性得以实现[11-12]。白藜芦醇还能够使环氧合酶Cox-1失活，上调NO信号通路来抑制血栓素TxA2合成， 减少具有强效血管收缩作用的内皮缩血管肽的生成[13]。在腹主动脉缩窄大鼠模型，白藜芦醇可以通过激活eNOS/NO信号通路逆转压力负荷诱导的心室肥厚和功能障碍[14]。在小鼠高血压模型，平滑肌细胞的增殖使管壁的顺应性降低，而白藜芦醇能够阻止年龄依赖的主动脉弹性能力的退化[11]，这可能是由于抑制了血管紧张素II诱导的平滑肌细胞增殖[15]。

白藜芦醇是一种具有广泛生理和药理学作用的化合物，具有改善血管内皮功能、舒张血管、抑制血管炎症反应、抑制血小板聚集和血栓形成、抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、抗血管内皮细胞凋亡等多种心血管保护作用，而且经口服后能迅速被机体吸收、分布和代谢，具有较高的研究和应用价值。本研究首次通过维生素D3和尼古丁诱导的大鼠血管钙化模型的基础上观察到白藜芦醇具有降低血压和改善心脏功能的作用，为白藜芦醇的心血管疾病的防治提供了新的研究思路。

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