比格犬ERβ剪切异构体ERβ419沉默表达载体的构建及筛选

甘 艺，赵彦斌，陈福军，孙兆增，胡仲明，刘 冰，杨焕民，曾 林

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.实验动物中心，北京 100071；3.五棵树经济开发区动物卫生监督所，长春 130401)

比格犬ERβ419为该犬最新发现的ERβ剪切异构体，尚无其生物学功能的报道。ERβ419 cDNA序列由下丘脑-垂体-性腺轴提纯得到，ERβ419由1257个碱基组成，编码419aa，命名为ERβ419。研究未知基因的生物学功能通常借助于慢病毒介导RNAi重组载体，本实验旨在筛选最有效的沉默表达载体，为后续探索比格犬ERβ419的生物学功能提供试验材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：

无内毒素质粒小提试剂盒、GenFectinTM基因转染试剂、为Biomed品牌产品，4×SDS上样缓冲液为Solarbio品牌产品，胎牛血清、DMEM高糖培养基为Hyclone品牌产品，0.25%EDTA胰酶、PBS缓冲液、1 mol/L Tris-Cl、1.5 mol/L Tris-Cl为Solarbio品牌产品、抗MYC标签兔单克隆抗体(GTX115046)为GENETEX品牌产品，抗GAPDH兔多克隆抗体(CW0101)、HRP标记兔二抗(CW0103)为康为品牌产品，DMSO为Invitrogen品牌产品，G418为Gibco品牌产品，T4 DNA Ligase和PrimeScript RT reagent Kit，SYBR®Premix Ex TaqTMII是TaKaRa品牌产品，胰蛋白胨、NaCl、酵母粉、脱脂奶粉等均为国产试剂。

1.1.2 菌种及细胞株：

pcDNA3.1-MYC-ERβ419重组质粒菌液及质粒、pGLV3/H1/GPF+Puro载体和HEK293T细胞由本实验室冻存。

1.2 试验方法

1.2.1 稳定表达ERβ419蛋白细胞株的构建

1.2.1.1 构建稳定表达ERβ419基因的细胞株

将细胞计数后适宜数量接种于6孔板中，高糖DMEM完全培养基(含有10%FBS，无双抗)培养18～22 h。细胞铺板底70%～80%时进行转染。将4 μg pcDNA3.1-Myc-ERβ419重组质粒及10 μL GenFectinTM基因转染试剂分别稀释于50 μL 0.15 mol/L NaCl中，两者再轻柔混合，室温静置5 min，混合液加入6孔板培养基中，培养24 h。

将瞬时转染的细胞以适当倍数稀释于100 mm细胞培养皿中，并设对照组细胞(同等数量的HEK293T细胞)；待细胞贴壁，并铺至瓶底50%～70%时，加入含有青链霉素浓度为100 μg/ mL和G418浓度为800 μg/ mL的筛选培养基；每2～3日更换一次筛选培养基；待对照组细胞全部死亡，挑取单克隆细胞至96孔板中用完全培养基继续培养；每2～3 d更换一次半浓度筛选培养基；筛选28 d后，可见有抗性的细胞团未发生死亡，生长状态良好，即可停药，扩大培养；当细胞量达到一定数量时，即可检测目的蛋白的表达。

1.2.1.2 蛋白质印迹法检测目的重组真核表达载体在HEK293T 细胞中的表达

收集待测细胞于离心管，每管加入500 μL 细胞裂解液，4℃全速离心30 min；取上清，用BCA法测定上清蛋白浓度；加适量4×SDS上样缓冲液；沸水浴10～15 min，待10%SDS-PAGE胶干后，每个胶孔加入等质量蛋白；恒电压电泳；蛋白胶恒电流转印至0.45 μm PVDF膜；蛋白膜用5%脱脂奶粉封闭0.5～1 h后，按实验需要剪裁蛋白膜；目的蛋白膜放入抗Myc标签兔单抗1：1000稀释液，GAPDH蛋白膜放入抗GAPDH兔多克隆抗体1：5000稀释液，孵育4℃过夜；TBST洗膜3次，每次7 min；加入HRP标记兔二抗1：3000稀释液，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次7 min；待目的蛋白膜和GAPDH蛋白膜半干后，按原位置拼接，逐滴添加发光试剂盒A/B液等体积混合液，反应1 min，去除混合液后，即可显影。

1.2.2 针对ERβ419基因慢病毒介导RNAi重组载体的构建

1.2.2.1 ERβ419基因shRNA序列的设计

依据siRNA设计原则，选择ERβ419基因CDs序列为RNAi靶序列，在(网址http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/rnai.html)上针对每条目的基因设计出三对互补的siRNA模板序列，以5’-TTCAAGAGA-3’为发夹状，每个基因设计三条特异性shRNA环形序列，并采用Blast软件对选择的三条靶序列进行同源分析，排除shRNA特异性地抑制其他基因片段的可能。再在shRNA碱基序列的5‘端和3’端分别加入限制性内切酶BamHI和EcoRI的酶切位点，最后将shRNA序列插入pGLV3/H1/GPF载体中；三条shRNA的寡核苷酸，分别为：

shRNAl:5’-GATCCgctgtgatgaattacagtaTTCAAGA GAtactgtaattcatcacagcTTTTTTG-3’;shRNA2:5’-GAT CCggtcgtgtgaaggatgtaaTTCAAGAGAttacatccttcacacgacc TTTTTTG-3’;shRNA3:5’-GATCCgctcttggcaacaacttca TTCAAGAGAtgaagttgttgccaagagcTTTTTTG-3’;shNC:5’-GATCCGttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacac gttcggagaaCTTTTTTG-3’。将构建成功的重组质粒送往江苏吉玛生物公司合成慢病毒，病毒滴度为108。

1.2.2.2 慢病毒转染病毒复数值(MOI值)的测定

将HEK293T细胞按3×103/孔细胞量接种于96孔板中；空白对照和实验组分组铺板后，添加无青链霉素的完全培养基至150 μL，培养18～22 h；取干净1.5 mL离心管4支，分别加入90 μL新鲜完全培养基。向第1支离心管添加10 μL病毒原液，混匀后吸取10 μL加入第2支离心管中，以此类推，4支离心管中慢病毒浓度依次稀释10倍，混合均匀；弃废液，加入预混稀释后的病毒液，空白对照组加入100 μL完全培养基，培养24 h；弃旧病毒液，加入150 μL 完全培养基，培养48 h；在荧光显微镜下观察侵染细胞的荧光效率，并计算慢病毒的MOI值。

1.2.3 实时荧光定量PCR和Western Blot检测ERβ419 RNAi慢病毒重组载体的干涉效率

1.2.3.1 引物荧光定量PCR特异性设计

根据GenBank中β-actin(AF021873)基因和比格犬ERβ剪切异构体ERβ419编码区序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，并且通过NCBI中Blast序列比对功能，初步检测引物的特异性。引物由北京Biomed生物技术公司合成。

1.2.3.2 慢病毒侵染目的基因稳转细胞系

按照2×105个/孔将稳转细胞均匀铺至细胞6孔板中，实验分为正常培养组，无关序列组，shRNA1组，shRNA2组，shRNA3组。每孔加入完全培养基至2 mL，培养18～24 h；取干净1.5 mL离心管4支，吸取1 mL新鲜完全培养基，加入适量病毒原液，混合均匀，弃实验组旧培养基，加入病毒稀释液，正常培养基组加入同等体积的完全培养基，培养24 h；弃废病毒稀释液，加入2 mL完全培养基，培养36 h；根据实验需要，采用适当的试验方法，处理侵染慢病毒的靶细胞。

1.2.3.3 慢病毒侵染目的基因稳转细胞RNA的提取

用于提取RNA的耗材、塑料器皿均经0.1 % DEPC水浸泡24 h，高压灭菌处理，氯仿、异丙醇及75%乙醇4℃预冷，6孔板中每孔加入1 mL Trizol，反复吹打细胞，将细胞-Trozol混合液收集用移液枪吸出，转入1.5 mL离心管中，冰上放置5～10 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低温离心15 min；将上层水相转入新的1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低温离心15 min；弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，用1 mL移液器吹起沉淀；7 500 g，4℃低温离心5 min；弃去乙醇并瞬时离心，小心吸弃并蒸发管内液体；加入预冷的适量0.1% DEPC处理水溶解总RNA；仪器测定 A260/A280 吸光度，定量总 RNA 的浓度和纯度。取1 μg RNA混合液加入0.1% DEPC 处理水配制的1%琼脂糖凝胶槽中，150 V，10 min，检测总RNA的完整性；根据实验需要适当用0.1% DEPC 处理水稀释 RNA。

1.2.3.4 反转录反应

按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒的说明书在冰上配制操作。反应条件为37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA于-20℃保存。

1.2.3.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测RNAi重组慢病毒载体干涉效果

按照SYBR®Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)试剂的说明书在冰上配制操作。反应条件为预变性 95 ℃ 30 s；变性 95 ℃ 5 s，退火 58 ℃(β-actin)20 s/ 55 ℃(ERβ419)20 s，40个循环。融解曲线条件为95 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；55 ℃～94.6 ℃(每隔0.3℃采集一次荧光信号)循环133次，每组的样本均设3次重复；反应结束后，软件自动导出扩增动力学曲线、融解曲线和循环阈值(cycle threshold，Ct值)，由融解曲线判定PCR反应的特异性，根据标准曲线以及荧光曲线的Ct值计算定量结果。使用SPSS17.0统计软件处理实验数据，得到三条干涉序列对目的基因mRNA的抑制效果。

所有的样品同期做三次重复，数值以x±s表示。标准曲线反应结果由IQ5仪器自动收集、分析和导出。自动显示内参基因和目的基因的标准曲线方程、扩增效率R2以及直线方程系数(斜率)。

1.2.3.6 Western Blot技术检测ERβ419 RNAi重组慢病毒载体干涉效果

方法同1.2.1.2操作步骤。通过Photoshop 7.0绘图软件对五组实验组蛋白表达量差异进行分析。每组蛋白进行三次灰度分析，所得数据经SPSS17.0处理。

2 结果

2.1 筛选ERβ419阳性克隆细胞

经过长达28 d的G418筛选培养基的筛选，出现阳性克隆细胞。挑取至96孔细胞培养板中，利用半浓度G418筛选培养基的连续培养，细胞能够正常生长，状态良好，不再死亡，即为阳性克隆细胞。

2.2 Western Blot方法检测ERβ419阳性克隆细胞中表达

Western Blot结果显示，pcDNA3.1-MYC-ERβ419(列1)编码蛋白质在HEK293T细胞中的的分子量大小为47×103，证明目的蛋白稳定且高效表达(图1)。

注：1：pcDNA3.1-MYC-ERβ419；2：HEK293T细胞。

2.3 qRT-PCR和Western Blot检测ERβ419干涉序列在mRNA水平和蛋白水平的定量分析

通过IQ5荧光定量PCR仪自带软件的数据和Photoshop 7.0灰度分析软件，结合SPSS17.0分析软件得到以下数据(表2.1)，表明，ERβ419-shNC(P> 0.05)、ERβ419-shRNA2(P> 0.05)、ERβ419-shRNA1(P< 0.01)和ERβ419-shRNA3(P< 0.01)差异极显著，ERβ419-shRNA3的干涉效果最优。

表1 不同实验组目的基因mRNA和蛋白的表达情况

3 讨论

ERs首先是在哺乳动物体内的生殖系统器官中发现，并研究其对机体生殖生理的影响。随着研究方向的拓展和研究内容的深入，ERs的生物学功能已不再单纯的只作用于生殖系统，在骨骼、中枢伸进系统、心血管系统、内分泌系统、消化系统等方面也有涉及，对肿瘤的发生发展也有一定的影响。

ERs的高表达除了刺激生殖器官的发育和维持第二性征外，也可有效降低血液中的血脂含量，促进其恢复到正常水平，促进血管平滑肌松弛，降低血压、保护心肌[1-2]，抑制自由基对机体伤害，直接和间接影响胰岛素功能，调节血糖，有效预防阿尔兹海默病、帕金森病及骨质疏松症等疾病[3-7]。

但ERs的高表达对机体也有负面影响，一些生殖系统方面的疾病都是因此而发生的。主要发生在卵巢、子宫和胸腺等实质器官。卵巢产生卵细胞和雌激素。卵巢分泌的雌激素与靶细胞上相应受体接触和结合，激活有丝分裂原相关的生物学效应，诱导靶器官功能性亢进，最终导致卵巢疾病的发生[8]。卵巢癌变成为了最终且最恶劣的结果，其发病机制与雌激素信号通路有关。子宫作为雌激素调控的靶器官之一，其内膜细胞在妊娠期和发情周期发生周期性的增生和脱落。靶细胞受雌激素-ERs复合物的协同调节。实验证明，对于子宫的发育及功能而言，ERs的正常表达尤为重要，但其异常激活对子宫的正常发育产生影响[9]。子宫内膜异位症、子宫内膜腺癌、子宫肌瘤等疾病成为与ERβ相关的热点子宫疾病。子宫肌瘤细胞内ERs和E2含量均较正常肌组织高，较高含量的雌激素刺激子宫肌瘤内的较高表达的ERs，导致子宫肌瘤的快速增生。乳腺组织中的血管分布密集，使不同时期分泌量不断变化的雌激素到达间质组织、脂肪组织及上皮细胞腺状体等靶细胞，进而在青春期、月经周期和妊娠期不同生理期，完成乳腺的激素调节和生理功能。雌激素信号通路诱导乳腺细胞增殖和凋亡等功能，乳腺癌形成则因该信号通路异常导致[10-12]。

RNAi因针对特定基因高效沉默其表达而通常应用于未知基因生物学功能的研究，成为现今研究基因生物学功能的重要工具。科学家们试图通过调节雌激素或ERs的表达而起到预防和治疗疾病的效果。RNAi技术就是一种极佳的临床治疗办法。主要是设计针对致病基因或诱导致病基因mRNA的干涉序列，通过特异性dsRNA的靶向作用，沉默目的基因的表达，从而抑制了疾病的发生发展。试验方法上便于操作，且高效持久，技术成熟。

比格犬雌性生殖系统方面常会出现繁殖能力下降、生殖器官病变等诸多问题，其主要原因是下丘脑-脑垂体-性腺轴中雌激素正负反馈调节机制发生异常。这种机制也受到ERs的表达量、表达水平与表达时间的调控[13-15]。ERs选择性剪切机制产生的剪切异构体增加了蛋白质组多样性，使雌激素信号在比格犬的生殖生理中发挥多种调节作用，了解ERs剪切异构体的生理学功能成为改善该犬生殖系统功能异常的研究重点。

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