人结肠癌细胞系绿色荧光蛋白裸鼠移植瘤模型的建立与观察

胡文娟，梁 磊，尤金炜，方 天，刘 彪，陈 莉，贾春梅，许龙祥，恽时锋

(南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地， 南京 210002)

动物模型是人类肿瘤学研究的重要工具之一，人类肿瘤裸鼠移植模型已成为肿瘤学研究的重要方法。在人类肿瘤移植于裸鼠受体前，远期排斥作用和受体动物容易死亡是人类肿瘤异种移植成功率低的主要原因[1]。而且其还有操作复杂、观察困难等缺点。如今，裸鼠已能够广泛应用于肿瘤模型的建立与研究。

GFP裸鼠是本科室将绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein，GFP)导入BALB/c nude小鼠而得来。GFP现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。GFP裸鼠因自身含有标记蛋白与普通裸鼠相比而具有明显的优势，国内外目前关于普通裸鼠肿瘤模型的建立已有不少，但还未曾有使用GFP裸鼠建立肿瘤模型的例子。因此，将GFP裸鼠与普通裸鼠在肿瘤模型的建立方面做比较研究具有较大的科学意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物准备

分别取雌性SPF级裸鼠及GFP裸鼠(GFP nude)各10只，约为5～6周龄,体重15～20 g(裸鼠购于常州卡文斯实验动物有限公司【SCXK(苏)2011-0003】，GFP裸鼠为本科室提供【SCXK(军)2012-0014】)，将实验动物均置于无菌条件下饲养【SYXK(军)2012-0047】，饲料和水自由摄入，严格灭菌处理，保持一定的温度与湿度。

1.2 肿瘤细胞培养及收集

将人类结肠癌肿瘤细胞株KM12SM采用含10%胎牛血清的培养基，内含青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL，置37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。取处于对数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，离心3 min，弃上清液，经无血清的培养基液洗3遍次，细胞计数，加无血清培养基调整细胞浓度为1×107/mL。

1.3 动物模型构建

使用1 mL无菌注射器将细胞悬液分别注入GFP裸鼠及普通裸鼠右侧腋窝皮下，每只实验鼠的注射量为0.2 mL，约含细胞量2×106个。

1.4 成瘤情况观察

实验结束后，观察两组实验鼠的一般情况(饮食、饮水、睡眠、排泄、活动状态等)，成瘤时间(以肉眼可见瘤结节为标准)，每3 d测量并记录实验鼠的体重，测量瘤体长径、短径等，计算肿瘤体积(肿瘤体积=长径×短径2/2)，直至移植瘤全部坏死，绘制肿瘤生长曲线。

1.5 病理检查

处死实验鼠，剥取肿瘤组织及周围淋巴结，置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察肿瘤组织生长、浸润及转移情况。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况观察

GFP裸鼠与裸鼠均未见死亡，成瘤率100%。实验初期两组实验鼠精神状态较好，饮水、饮食正常，反应敏捷；随着后期瘤体的增大，均出现进食，活动减少，反应迟钝等现象，裸鼠体重下降较为明显。

2.2 肿瘤出现时间

GFP裸鼠组于接种后4～5 d在右前肢腋窝皮下长出肉眼可见的肿瘤，裸鼠组于接种后6～8 d在腋下长出可见肿瘤，差异显著。

2.3 肿瘤生长情况

实验鼠均长出肉眼可见的移植瘤，外观呈现不规则状，质地较硬，活动性好，与周围组织界限较清楚，并随着时间的推移而逐渐增大。根据表1及图1(肿瘤生长曲线图)显示，接种第16天开始，两组实验鼠测得的肿瘤体积存在显著差异(P< 0.05)，在成瘤后肿瘤生长速率方面，GFP裸鼠肿瘤生长速度比裸鼠要快；在接种第20天，裸鼠组测得体积约为(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠组肿瘤体积约为(4923.46±521.72)mm3，存在显著差异(P< 0.05)。据图2可直观的看出GFP裸鼠移植肿瘤生长情况优于裸鼠。图1,图2彩插4。

表1 GFP裸鼠与裸鼠皮下肿瘤的体积分析

2.4 肿瘤组织病理学观察

实验鼠处死后，取瘤体观察，均为球形结节状，肿瘤为非浸润生长；瘤体有完整的包膜包裹，与周围组织分界清晰，容易分离，剖面呈鱼肉状，血供丰富，瘤块中央可见局灶性坏死，GFP裸鼠瘤体体积比裸鼠瘤体更大一些。HE染色显示肿瘤细胞排列紧密，瘤细胞生长活跃，大小较为均匀，核质深染，染色质粗，部分区域可见腺腔形成。根据图3、图4所示(彩插4)，GFP裸鼠移植瘤瘤细胞比裸鼠瘤细胞排列更加紧密，可见瘤细胞生长情况更为活跃。肿瘤细胞分泌粘液，并侵犯周边结缔组织。

3 讨论

肿瘤已成为当前威胁人类最严重的常见病之一，每年死于肿瘤的人数以百万计，因此，建立肿瘤模型，进行防治研究，是基础医学研究中的重要课题[2]。肿瘤模型对研究肿瘤的病因、发病机制、抗癌药物筛选机肿瘤防治等具有非常重要的意义[3]。肿瘤分子生物学的迅猛发展迫切需要简便快速、成瘤时间短和稳定性好的动物模型，以此作为研究平台进行后续的药物或其他实验研究[4]。皮下移植瘤种植操作较为简便，创伤小，且易于测量瘤体直径，因此本实验采取皮下移植瘤这一动物模型制作方法进行研究比较。理想的肿瘤动物模型应具备以下条件：(1)致癌方法简便易行；(2)经济快速；(3)指标客观明确；(4)对癌变器官的特异性高；(5)重复性好；(6)诱发肿瘤的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化学改变应与人体肿瘤相似[5]。结肠癌动物模型也应如此。

本实验采用细胞悬液直接腋窝皮下注射的方法分别构建了GFP裸鼠及裸鼠结肠癌动物模型。GFP裸鼠组与裸鼠组均未见死亡，平均成瘤率100%，GFP裸鼠组于接种后4～5 d在右前肢腋窝皮下长出肉眼可见的肿瘤，裸鼠组于接种后6～8 d在腋下长出可见肿瘤，存在显著差异。随着后期瘤体的增大，两组均出现进食，活动减少，反应迟钝等现象，GFP裸鼠组的精神状态较裸鼠组稍好一些。从接种第16天开始，两组实验鼠测得的肿瘤体积存在显著差异(P< 0.05)，在接种第20天，裸鼠组测得体积约为(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠组肿瘤体积约为(4923.46±521.72)mm3，存在显著差异(P< 0.05)。根据肿瘤生长曲线，可直观显示成瘤后肿瘤生长速率方面，GFP裸鼠肿瘤生长速度比裸鼠要快。这些数据与廖前进[6]等报道的数据存在差异，可能与小鼠的品种，测量方法及生长环境等有关。

综上所述，可见GFP裸鼠在成瘤时间，精神状态，肿瘤质量等方面与裸鼠相比，具有一定的优势，肿瘤生长曲线图也可直观的看出GFP裸鼠组肿瘤生长情况优于裸鼠组。由于GFP裸鼠将绿色荧光蛋白基因导入BALB/c nude小鼠，使得自身含有标记蛋白，绿色荧光蛋白基因的导入可能改变了GFP裸鼠的蛋白表达，造成GFP裸鼠免疫功能与裸鼠比更为低下，还有待以后的进一步比较研究。通过本实验比较研究，我们可以看出GFP裸鼠较裸鼠而言，可为结肠癌淋巴转移的机制探讨和诊断治疗研究提供更为理想的动物模型。

参考文献：

[1] 梁文丰，郑琳，冯韵恬，等. PDTX裸鼠模型研究进展[J]. 中国科技论文在线精品论文. 2014,7(5)：398-402.

[2] 赵勇，伍静，毛峰峰，等. 裸鼠荷瘤实验中常见问题的解析和总结[J]. 中国比较医学杂志. 2012,22(7)：17-20.

[3] 李桂园，陈龙邦、臧静，等. C57BL/6小鼠黑色素瘤B16细胞株在ICR小鼠肿瘤模型的建立[J]. 医学研究生学报. 2003,16(4)：262-266.

[4] 唐杨琛，沈干，胡世莲，等. 两种方法建立人胃癌裸鼠移植瘤模型的比较[J]. 中国临床保健杂志. 2013，16(2)：180-182.

[5] 李友堂，李鸿茹，陈颖，等. 人肺腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立[J]. 福建医药杂志. 2010,32(1)：80-82.

[6] 廖前进，苏坚，何洁，等. DADS对人结肠癌SW480细胞裸鼠致瘤的影响[J]. 实用癌症杂志. 2010,25(3)：225-227.