用阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征动物模型研究vaspin与胰岛素信号通路的相关性*

庄向华， 倪一虹， 刘元涛， 孙爱丽， 孙福敦， 姜冬青， 李晓博， 陈诗鸿

(山东大学第二医院内分泌科，山东 济南 250033)

阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是一种发病率较高，有潜在危险性的慢性疾病，可引起心、脑、血管多组织多器官的损害，其确切的发生机制尚不清楚。肥胖、机体脂肪含量增多在OSAHS的发生中具有重要的作用。脂肪组织可分泌许多脂肪因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、脂联素(adiponectin, APN)、瘦素(leptin)、vaspin等，一方面以自分泌、旁分泌的形式调节脂肪细胞的生理功能，另一方面通过血循环作用于远处组织。Vaspin是一种新发现的脂肪因子，可参与糖脂代谢。Zvonic等[1]研究人脂肪组织vaspin mRNA表达发现与肥胖、胰岛素抵抗和糖代谢的参数相关。目前关于vaspin的基础和临床研究刚刚开始，脂肪因子vaspin功能及表达调控的分子机制有待进一步研究。既往研究结果发现OSAHS患者体内vaspin参与了糖脂代谢紊乱，并推测OSAHS并发胰岛素抵抗和高vaspin水平低有关。本实验旨在建立理想的模拟睡眠呼吸暂停综合征的慢性间歇性缺氧大鼠模型，从mRNA和蛋白水平分析OSAHS中脂肪因子vaspin与胰岛素信号途径中关键因子的相关性。

材 料 和 方 法

1 实验动物

雄性Wistar大鼠22只，购于山东大学医学院实验动物中心，体重160～200 g，标准饲料、专人单笼饲养，明暗周期为12 h，自由取食和饮水，室温18～25 ℃，相对湿度55%～80%。实验期间，不控制饮水，垫料消毒，每日更换。适应性饲养1周后，随机分为对照(control)组(n=12)，给予大鼠食用的标准饲料在常规环境中继续饲养；慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)组(n=10)，参照王璋等[2]的方法加以改进，每天9:00～17:00将大鼠放入间歇性低氧舱内，关闭舱门，向间歇性低氧舱循环充入氮气和压缩空气，每一循环为60 s，即30 s充入氮气，随之30 s充入压缩空气，由测氧仪监测间歇性低氧舱中的氧浓度，调节气体流量，使每一循环间歇性低氧舱内的最低氧浓度达到4%～6%，然后再逐渐恢复至21%。测氧仪检测结果提示：舱内气体氧浓度(fraction of inspired oxygen，FiO2)在低氧气体输入后逐渐减低至7%～8%，在此水平持续约5～7 s，然后随着空气的输入FiO2逐渐升至20%～21%，此实验共持续8周。安静环境下，将大鼠放入鼠袋内，待其安静后应用尾套管法检测大鼠尾动脉压。每次测量3次，取3次数值的平均值。8周后2组大鼠空腹12 h，颈动脉取血测定血糖，并分离血清于 -70 ℃保存用于生化指标检测；取血结束后处死动物，留取脂肪标本 -70 ℃保存备用。

2 实验方法

2.1动脉血气检测 在预实验中随机选取4只大鼠间歇低氧条件下的动脉血氧饱和度变化情况。方法为：先将大鼠用苯巴比妥钠(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，放入间歇缺氧舱中，进入麻醉状态后，将其腹部朝上固定于解剖台上，局部消毒后，切开腹部皮肤，2只在缺氧舱内氧浓度降至最低点30 s内直视下抽取腹主动脉血，应用动脉血样行血气分析，另外2只大鼠在循环充气过程中当缺氧舱内氧浓度恢复至21%时同样方法抽取。

2.2血清学指标检测 大鼠尾静脉取血，离心后分离血清，将血清样品放入低温冰箱中保存，供以后测定时使用。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，使用强生稳豪型One Touch Ultra Easy 血糖仪测定(Life Scan)。血清总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平应用Beckman DXC 800型生化自动分析仪测定。血清胰岛素采用放射免疫法测定(Linco Research)。用内环境稳态模式评估计算胰岛素抵抗指数(homeostic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)：HOMA-IR =空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG； mmol/L)×空腹胰岛素(fasting insulin, FINS; mU/L)/22.5。采用酶联免疫吸附法测定血清vaspin和脂联素(武汉 USCN Science生物有限公司)浓度，严格按照试剂盒说明书操作。

2.3Real-time PCR 方法检测mRNA表达 应用实时荧光定量PCR检测vaspin、Akt 和GAPDH mRNA的表达。采用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，取100 mg 左右的脂肪组织，按照说明书操作，RNA于紫外分光光度计定量后于-80 ℃储存备用。采用反转录反应试剂盒合成cDNA，按照说明书操作。PCR反应条件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环； 72 ℃ 10 min。于每个循环延伸反应最后时刻收集荧光信号；熔解曲线设置：95 ℃ 1 s，60 ℃ 2 min，以0.2 ℃/s的升温速度升温至95 ℃，升温时连续收集荧光信号。应用实时荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500 Detection System) 检测。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物序列如下： vaspin的上游引物为5’-AGTCGGAAAACCCACAACAG-3’，下游引物为 5’-CGGTCTTGCCTTCCTCTATG-3’； Akt上游引物为5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’，下游引物为5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’； GAPDH的上游引物为5’-GCTGATGCCCCCATGTTTG-3’，下游引物为5’-GGGTGGTGGACCTCATGGC-3’。

2.4Western blotting蛋白水平表达 在冰冻缓冲液中研碎脂肪组织(50 mg)，提取蛋白，在4 ℃、 20 000 r/min条件下离心20 min，小心吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度，确定上样量。取50 mg蛋白在95 ℃温度下变性5 min，SDS-PAGE分离蛋白并转移到PVDF膜。封闭1 h，应用vaspin、 Akt 和p-Akt抗体(Santa Cruz)孵育，洗膜后加5 μL II抗(1∶2 000)与10 mL封闭缓冲液中充分混匀，加入PVDF膜。取出PVDF膜放入发光液，反复浇PVDF膜约5 min，取出PVDF膜，吸干过多液体，保鲜膜包裹PVDF膜，置于曝光盒中，显影、定影。GAPDH作为内参照，用多功能数字图像分析仪Kodak Digital Science ID软件进行分析。

3 统计学处理

全部实验数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，偏态分布变量经对数转换后进行比较，两样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动物体重、血压变化

实验前后2组大鼠之间体重无显著差异，实验前2组大鼠尾动脉收缩压无显著差异。实验后CIH组大鼠收缩压明显高于正常对照组。

2 血压和血氧饱和度检测

随机选择4只大鼠进行预实验，结果显示缺氧最低点时大鼠尾动脉血压23.4 mmHg～32.8 mmHg，最低血氧饱和度范围为40.8%～65.9%，恢复舱内氧浓度至2l%后，测得尾动脉血压为74.5 mmHg～102.9 mmHg，动脉血氧饱和度为93.8%～98.9%，符合人类阻塞型睡眠呼吸暂停综合征诊断标准。

3 血清学指标

实验结束后抽血测FPG、FINS、TG、TC、APN和vaspin浓度。结果提示：与control组相比，CIH组大鼠的FPG、FINS、TG、TC、vaspin和HOMA-IR(P<0.01或P<0.05)水平显著升高，APN水平显著降低(P<0.05)，2组大鼠体重未见显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 2组大鼠体重及各实验室指标

4 相关分析

血清vaspin与血糖、脂代谢和胰岛素抵抗的相关分析，Pearson相关分析结果提示vaspin浓度与FINS、TG和HOMA-IR显著相关(P<0.05)，与FPG和TC无明显相关(P>0.05)。

5 2组大鼠vaspin和Akt mRNA表达水平比较

Real-time PCR方法检测大鼠脂肪组织vaspin和Akt的mRNA水平。与control组相比，CIH组大鼠脂肪组织vaspin的mRNA表达水平增加10%，Akt 的mRNA表达水平无明显改变，见图1。

6 2组大鼠脂肪组织vaspin和Akt蛋白表达的比较

CIH组大鼠腹部脂肪组织中vaspin蛋白水平较正常对照组大鼠显著增加。2组大鼠脂肪组织中Akt的蛋白水平无明显区别，而CIH组大鼠的p-Akt蛋白水平较control组明显降低，见图2。

Figure 2. Protein levels of vaspin, Akt and p-Akt in adipose tissue.Mean±SD.*P<0.05 vs control group.

讨 论

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征是一种近20年来才被人们认识并引起重视的具有潜在危险的常见疾病[3]，其中最常见的是OSAHS。OSAHS主要表现为睡眠时反复上气道塌陷导致打鼾、频繁呼吸暂停及呼吸浅慢、低氧血症、睡眠中断，呼吸睡眠节律紊乱，反复出现呼吸暂停及觉醒；由于缺乏足够的肺泡通气导致反复发作的急性低氧血症、高碳酸血症。在睡眠时可发生急性呼吸衰碣，长期反复发作也可导致慢性呼吸衰竭、肺动脉高压、肺心病、冠心病、脑动脉硬化症等疾病，这些疾病之间通常存在一个共同的病理生理状态，即胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。

本研究的动物造模实验中提示大鼠存在代谢紊乱，对比2组大鼠，CIH组大鼠的血压、空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、胆固醇、HOMA-IR和vaspin水平显著高于正常对照组，而脂联素水平显著低于正常对照组；显示CIH大鼠出现了机体代谢紊乱。近年来文献报道模拟OSAHS患者低氧模式的慢性间歇低氧可导致大鼠持续性血压升高，其机制可能有：(1)慢性间歇低氧可能通过激活肾素-血管紧张素系统而导致高血压发生；(2)机体对乙酰胆碱和异丙肾上腺素舒血管反应降低；(3)慢性低氧导致肾素-血管紧张素-醛固酮活性增加等。我们用大鼠尾压测量仪测量血压，结果表明间歇低氧组大鼠的尾动脉血压明显高于正常对照组，说明慢性间歇低氧导致了大鼠持续性血压升高。人群的研究显示OSAHS患者中糖耐量异常发生几率显著高于正常对照组，普通人群中糖尿病的发病率约5%，而在50～59岁2型糖尿病中OSAHS发病率可高达17%。OSAHS患者存在胰岛素的反应性下降和胰岛素抵抗，最终导致高血糖。OSAHS动物模型亦发现2组动物的胰岛素抵抗指数存在显著差别，提示OSAHS与胰岛素抵抗显著相关。

脂肪细胞因子在OSHAS致胰岛素抵抗中亦起到重要的作用。研究显示脂肪因子参与了胰岛素敏感性、脂质代谢、炎症和免疫应答等过程，与肥胖、糖脂代谢异常等相关性疾病密切相关[6]。脂联素是专一由脂肪细胞分泌的一种糖蛋白，是目前发现的明确具有抗炎、抗动脉粥样硬化、增加胰岛素敏感性及改善胰岛素抵抗等多种生物学效应的脂肪因子[4]。Zhang等[5]研究发现OSAHS组血清脂联素水平较对照组明显下降，在控制BMI、腰围、颈围和胰岛素抵抗指数这些因素后，血清脂联素水平与AHI呈明显负相关，与动脉血氧饱和度呈正相关。我们的研究结果显示，与正常对照组相比，CIH组大鼠脂联素水平显著降低，与既往研究结果一致，进一步证明了脂联素在OSAHS患者中的意义。

Vaspin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，是由约395个氨基酸组成的具有疏水性N端的单肽。Vaspin与胰岛素抵抗相关指标的相关性目前亦结论不一。在脂肪组织的体外培养研究中，给予vaspin后可逆转肥胖小鼠体内与胰岛素抵抗相关基因的表达，如瘦素、抵抗素、TNF-α和葡萄糖转运载体4等。基因芯片检测显示，vaspin治疗肥胖小鼠可逆转50%的高脂肪或高糖饮食所诱导的基因表达，提示vaspin可通过调控脂肪组织中与胰岛素抵抗相关基因的表达而改善胰岛素敏感性。也有研究未发现重组人vaspin对培养的3T3-L1脂肪细胞具有葡萄糖代谢调节基因表达的作用以及对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响作用，推测其原因可能是由于肥胖状态下，vaspin发挥胰岛素增敏作用依赖于其靶向丝氨酸蛋白酶的存在；但该丝氨酸蛋白酶存在于白色脂肪组织中，不存在于培养的脂肪细胞中。本研究结果显示CIH组大鼠血清vaspin浓度增加，且其血清浓度与胰岛素、HOMA-IR、SaO2水平相关，提示其与胰岛素抵抗是相关的。而取脂肪组织进行实时荧光定量PCR检测，结果提示vaspin mRNA表达水平在CIH大鼠的脂肪组织中较正常对照组大鼠明显增加，应用Western blotting检查，结果提示vaspin蛋白在脂肪组织表达亦呈升高趋势。

磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)家族是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。Akt通路主要负责由PI3K始动的生物信息的传导, Akt处于这一通路的中心环节，它在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用，与胰岛素抵抗的发生发展密切相关。PI3K/Akt信号通路是胰岛素的主要信号通路，我们选择在PI3K/Akt信号通路中最重要的p-Akt和Akt作用研究靶点，探讨在OSAHS中胰岛素抵抗的特点。应用Western blotting方法检测2组动物脂肪组织蛋白表达水平，提示在2组Akt蛋白表达无明显差异，而p-Akt蛋白表达有显著差异，实验组的CIH大鼠p-Akt蛋白表达水平较正常对照组显著下降，进一步支持我们造模的CIH大鼠存在显著的胰岛素抵抗，同时提示vaspin蛋白在胰岛素信号途径中可能存在潜在作用。

综上所述，通过间歇性低氧制造的CIH大鼠中，存在典型的胰岛素抵抗，同时2组动物中vaspin浓度以及蛋白表达存在差异。若今后能够进一步明确vaspin的在OSAHS发病机制中的确切作用将有助于我们对于OSAHS的治疗。另一方面，虽然基础研究发现vaspin具有胰岛素增敏作用，但临床研究中vaspin与胰岛素敏感性之间的关系尚存在分歧，今后尚需大样本的临床研究进一步证实。

[参 考 文 献]

[1] Zvonic S, Lefevre M, Kilroy G, et al. Secretome of primary cultures of human adipose-derived stem cells: modulation of serpins by adipogenesis[J]. Mol Cell Proteomics, 2007, 6(1):18-28.

[2] 王 璋，司良毅，廖友斌. 大鼠睡眠呼吸暂停综合征动物模型的建立[J]. 中国实验动物学报, 2006, 14(1):40-43.

[3] 刘辉国, 林 玫, 管 频, 等. 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征外周血IGF-2 及其mRNA水平变化的初步研究[J]. 中国病理生理杂志, 2007,23(9): 1782-1785.

[4] 孙升云，黄 进，孟民杰，等. 山荷减肥颗粒对饮食诱导肥胖大鼠瘦素、脂联素、抵抗素的影响[J]. 中国病理生理杂志，2009,25(6):1170-1174.

[5] Zhang XL, Yin KS, Wang H, et al. Serum adiponectin levels in adult male patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome[J]. Respiration, 2006, 73(1):73-77.

[6] Carneiro G, Togeiro SM, Ribeiro-Filho FF, et al. Continuous positive airway pressure therapy improves hypoadiponectinemia in severe obese men with obstructive sleep apnea without changes in insulin resistance[J]. Metab Syndr Relat Disord, 2009, 7(6):537-542.