Sp3对β-catenin基因转录调控作用初探*

黄兰姗， 黄子凌， 冯振博， 陈 罡， 危丹明

(广西医科大学第一附属医院病理科，广西 南宁 530021)

特异性蛋白(specificity protein，Sp)家族属于特殊转录因子，含有高度保守的DNA结合区域，在羧基端有3个串联的 Cys2His2型锌指结构域，能与GC/GT盒及基本的转录元件结合。转录因子Sp家族通过调控下游靶基因，广泛参与细胞内的转录调控，涉及几乎所有细胞功能，包括细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等。其中，Sp3在多种组织中广泛表达，其转录调控作用具有特殊性，扮演着转录激活或者转录抑制的双重角色。家族成员在结构与功能上既有相似性也有各自的特性，在Sp家族中，前人的研究多集中于Sp1，而关于Sp3调控的下游基因情况的研究报道甚少。

β-catenin作为连环蛋白家族中的一员，具有介导细胞黏附和Wnt/β-catenin信号转导的双重活性，其在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生发展中的作用倍受关注，研究多集中于β-catenin蛋白的过表达、磷酸化、基因突变等[1-2]。部分学者发现Sp家族与Wnt/β-catenin信号通路之间存在联系，提出β-catenin是Sp调控的下游基因之一[3]。本课题组前期实验亦发现，在肝癌细胞株HepG2中运用RNAi下调Sp3后，β-catenin的表达随之减少，而且细胞增殖能力明显减弱，周期阻滞在G0/G1期[4]；在裸鼠人肝癌种植瘤模型中，Sp3可通过上调β-catenin及其下游基因MMP-9表达，同时下调E-cadherin的表达，增强人肝癌细胞的侵袭能力[5]；基因芯片结果亦提示肝癌细胞株HepG2中Sp3下调后β-catenin的变化与前期实验一致[6]。这些均提示在HCC中Sp3与β-catenin存在联系，Sp3作为转录因子可能直接或间接调控β-catenin的表达，然而具体联系与机制尚未清楚。本研究拟在前期研究的基础上，通过双萤光素酶报告基因实验进行Sp3与β-catenin启动子结合的预测与验证，初步研究转录因子Sp3对β-catenin启动子活性的影响，从而探索Sp3对Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的作用机制，为HCC中Sp3的调控网络及作用原理提供依据。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚肾上皮细胞HEK-293T(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基和胎牛血清(Wisent)，Opti-MEM不完全培养基(Gibco)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)；β-catenin启动子报告基因质粒(pGL3-β-catenin)、Sp1表达质粒(pcDNA3.1-Sp1)、Sp3表达质粒(pcDNA3.1-Sp3)和阴性对照质粒(pcDNA3.1)由上海吉凯基因公司构建，PRL-TK质粒由Promega提供。

2 主要方法

2.1生物信息学分析 在NCBI上查找人β-catenin的基因信息，预测启动子区域为转录起始位点与上游2 000 bp之间，利用TFSEARCH软件预测、分析此启动子区域的转录因子结合位点，根据转录因子Sp3结合位点的情况截取启动子序列进行报告基因质粒的构建。

2.2细胞培养与瞬时转染 293T细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养液, 于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的CO2恒温培养箱。细胞分3组：实验组(启动子+转录因子质粒)、阴性对照组(启动子+阴性对照质粒)和mock对照组。将处于对数生长期的293T细胞接种于96孔板中，待细胞长至70%～80%融合率时以脂质体法转染。pGL3-β-catenin分别与pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Sp3、pcDNA3.1(剂量梯度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μg)转染293T细胞，观察Sp1或Sp3单独转染对β-catenin启动子活性的影响。根据实验结果选取对β-catenin启动子转录活性的促进作用最强的剂量，后以该总量的pcDNA3.1-Sp1和pcDNA3.1-Sp3，设计不同比例，观察Sp1与Sp3共同转染对β-catenin启动子活性的影响。以上转染均加入内参照pRL-TK质粒。转染48 h后进行萤光素酶活性的检测。

2.3双萤光素酶报告基因检测 96孔板内每孔加入30 μL 1×细胞裂解液(PLB)，室温条件下用摇床充分裂解20 min。将细胞裂解液转移至1.5 mL EP管，加入100 μL 萤火虫萤光素酶底物，混合均匀，用单管发光计检测每个样本的发光强度，即为萤火虫萤光素酶活性(firefly luciferase activity，FLA)。每管再加入100 μL 反应终止液(Stop & Glo)，用单管发光计检测每个样本的海肾萤光素酶活性(Renillaluciferase activity，RLA)。将FLA除以RLA进行标准化，再计算实验组相对于阴性对照组的相对萤光素酶活性。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，各组样本均数比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。实验重复3次以上。

结 果

1 人β-catenin基因启动子内Sp结合位点预测

通过生物信息学分析，发现β-catenin基因CTNNB1启动子区域存在3个Sp1结合位点，无Sp3特异性结合位点。由于Sp3与Sp1结构比较相似，能识别并以相似的亲和力结合经典的Sp1结合位点，故选择此3个位点进行研究。以下为截取的启动子片段(410 bp，划线部分为3个Sp1结合位点)：(-410 bp)CCGAGCGGTACTCGAAGGCCGGGGCCGA-GATGCCACCTTCCGCAGGCCGCGGGAAAGGCGCGCC-GAGTCCTGCAGCTGCTCTCCCGGTTCGGGAAACGC-GCGGGGCGGGGGCGTCGGGCTTGGGACAGGGGAG-GATACCAGGGCCACCTTCCCCAACCCAGGCCGCG-GGGGCCCGGCCTCCCCGATGCAGACCACAGCGCCC-TCACGGGCTGCCCTCAGGCCGCGCAGCGGGCAGCC-GCCAGCCGTCACCCCGGGGAGCGTCCGTGGGGTGC-CCAGGCACCCCACCCCGGCCCGGGGCGCTCAGACG-GCAGCAGACTGCTGGGCGGCGCGGGGACTACTTTC-CAC-CGCCCCCTCGCGCCCCGCCCCTTGTCCTCGCG-CGGCGGAACGCTCCGCGCTGCGCCGGTGGCGGC(-1 bp)。

2 Sp1或Sp3单独转染对β-catenin启动子活性的影响

2.1Sp1对β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)转录活性的影响 双萤光素酶报告基因检测结果显示，Sp1表达质粒pcDNA3.1-Sp1在0.4～0.5 μg时增强启动子活性，并且在0.4 μg时能提高启动子的活性2.4倍，但与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

Figure 1. Effect of Sp1 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.

2.2Sp3对β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)转录活性的影响 双萤光素酶报告基因检测结果显示，Sp3表达质粒pcDNA3.1-Sp3在0.1 μg时抑制β-catenin启动子活性，而其它剂量均提高启动子活性，尤其在0.4 μg时能提高启动子的活性5.3倍，与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Figure 2. Effect of Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

3 Sp1和Sp3共同转染对β-catenin启动子活性的影响

双萤光素酶报告基因检测结果显示，共同转染时，随着Sp3/Sp1比例的递增，即Sp3浓度增加，Sp1浓度降低，β-catenin启动子活性相近，无明显变化。pcDNA3.1-Sp3转染量为0.4 μg 时启动子活性最强，与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Effect of co-transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

4 比较Sp1、Sp3单独转染与共同转染对β-catenin启动子活性的影响

单独转染Sp1 0.3 μg时，相对活性值为0.4，单独转染Sp3 0.1 μg时，相对活性值为0.5，两者共同转染时相对活性值为3.5，见图4A，此组为共转染后转录活性变化最大者，其它组亦出现共转染后启动子转录活性增强，见图4B、C。

讨 论

特殊转录因子仅与其靶启动子中的顺式作用元件结合，从而对基因的表达起增强或抑制作用，萤光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。结合前期实验结果，我们根据文献以及软件预测结果(β-catenin启动子区域存在3个Sp1结合位点)，选择-410 bp到-1 bp之间的序列进行转录研究，通过萤光素酶报告基因实验对转录因子Sp1与Sp3对β-catenin启动子的转录调控作用进行了初步的探讨。

Sp1或Sp3单独转染时，Sp3对β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录活性有明显的增强作用，而Sp1对β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录活性的增强作用较弱，说明在β-catenin基因的表达过程中，Sp3主要起着促进转录的作用。Sp3作为特殊转录因子在β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)区域，与预测结合位点结合，调控转录过程，从而解释前期实验结果。在HCC组织、细胞、裸鼠成瘤中Sp3均对β-catenin的表达起促进作用，可能是在转录水平调控β-catenin的表达。

Figure 4. Effect of transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). A: transfection of 0.3 μg Sp1 and 0.1 μg Sp3; B: transfection of 0.2 μg Sp1 and 0.2 μg Sp3; C: transfection of 0.1 μg Sp1 and 0.3 μg Sp3.Mean±SD.n=3.

通过不同浓度的Sp1和Sp3共转染，进一步研究Sp1与Sp3之间的相互作用以及对β-catenin基因启动子活性的影响。发现随着Sp3浓度升高，Sp1浓度降低，即Sp3/Sp1比例的递增，β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录活性无明显变化，说明Sp3与Sp1表达比例的变化并未明显影响靶基因的转录活性。同时，随着Sp1和Sp3以不同浓度共转染，与Sp1或Sp3单独转染相比，共转染后该启动子活性增强，说明Sp1与Sp3共同存在时对转录起促进作用，两者可能存在协同作用。

Sp作为特殊转录因子含有高度保守的DNA结合区域，在羧基端有3个串联的Cys2His2型锌指结构域，能与GC(GGGGCGGGG)/GT(GGTGTGG)盒及基本的转录元件结合。Sp1、Sp3和Sp4结构比较相似，均含有2个谷氨酸转录激活区(TADs)，三者能识别并以相似的亲和力结合经典的Sp1结合位点[7-8]。其中，Sp1与Sp3蛋白的DNA结合区序列有90%以上的同源性，Sp1和Sp3的结合序列GC/GT盒常以多拷贝形式分布于基因的启动子或增强子中，Sp1和Sp3以相似的亲和力结合这些基因调控区的GC/GT盒，并且与核内其它因子相互作用，发挥对基因转录的增强或抑制作用[9-10]。

与本研究结果不同的是，在大多数报道中，Sp3表现出转录抑制作用，Sp1与Sp3的相对表达水平影响基因的转录：Sp3与Sp1比例的下降能增强启动子转录活性，比例升高则抑制启动子转录活性。如Wong等[11]在结肠癌Caco-2细胞进行萤光素酶报告基因检测发现，Sp1增强MAOB基因的启动子转录活性，Sp3轻微抑制其活性，共转染Sp1和Sp3后，下调Sp3/Sp1的比例则提高了MAOB基因的启动子转录活性。Schwarzmayr等[12]在骨肉瘤U2-OS细胞进行萤光素酶报告基因检测发现，Sp1能显著增强EAPP基因启动子活性，Sp3则表现出抑制作用，上调Sp3/Sp1的比例则抑制EAPP基因启动子活性。吴军峰等[13]亦有相似报道。

在不同研究中Sp3表现出不同的转录活性，我们认为可能与以下因素有关：(1)不同的Sp3蛋白亚型，主导的功能不同：较短的Sp3亚型发挥抑制作用，而全长的Sp3亚型则发挥激活作用[14]；(2)识别位点的结构和排布影响Sp3的调控作用：当启动子包含1个结合位点时Sp3可能作为激活因子，如果启动子包含多个结合位点时Sp3则发挥抑制作用[15]；(3)Sp1和Sp3的相对表达水平影响Sp3对靶基因的表达调控，当Sp1存在时Sp3表现出抑制作用[16]；(4)其它蛋白质因子对Sp3活性的影响，如其它蛋白质因子与Sp3的结合能影响其调控转录[9]；(5)翻译后修饰对Sp3转录调节活性的影响，如Sp3的乙酰化、苏素化等[17]；(6)染色质的修饰和结构对Sp3转录调节活性的影响[18]等。

目前关于β-catenin表达调控的机制，β-catenin顺式作用元件和相关的反式作用因子的报道甚少，本课题组率先对β-catenin启动子区域的Sp结合位点进行了转录调控研究。Nollet等[19]通过基因扩增测序，提出β-catenin基因启动子区包括转录因子NF-κB、Sp1、AP2和EGR1的结合位点。张菊等[20]采用PCR方法首次克隆CTNNB1基因5’上游1.8 kb(-1 650/+150)启动子，并预测该区域富含GC盒以及多种转录因子结合元件如：NKX HP/N KX31、P53F、PERO、RREB和E2FF等。本研究通过萤光素酶报告基因实验发现，对于β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)，转录因子Sp3起着转录激活的作用，Sp1则表现出较弱的转录激活作用，Sp3/Sp1比例的递增对β-catenin基因启动子转录活性无明显影响，Sp1、Sp3共同作用则能促进转录。由此我们推测，Sp3作为转录因子可能直接或间接调控β-catenin的正向表达，造成β-catenin蛋白在细胞内积聚、核转位，进而过度激活Wnt/β-catenin信号通路中的下游靶基因，促进细胞增殖、迁移侵袭等。

综上所述，Sp3可能通过β-catenin影响Wnt/β-catenin信号通路，进而参与HCC的发生发展。而双萤光素酶报告基因实验的结果尚不能确定在HCC细胞内Sp3直接与β-catenin启动子区域结合，仍需更深入的研究去探索体内细胞是否存在此调控关系。

[参 考 文 献]

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