PYNOD对LPS活化的BV2小胶质细胞炎症因子释放的影响*

曾 琪， 戚仁斌， 胡巢凤， 陆大祥△

(1赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000； 2暨南大学医学院病理生理学系，广东 广州 510632)

小胶质细胞广泛分布在大脑和脊髓中。中枢神经系统变性疾病过程中的免疫异常主要表现为小胶质细胞过度活化，特定脑区炎症因子水平升高[1]。在许多神经系统变性疾病中，如帕金森病(Parkinson disease, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)及多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)等，都出现了小胶质细胞的过度活化和增殖，这是中枢神经系统疾病炎症反应的一个重要表现。

文献报道，小胶质细胞过度活化不断释放一氧化氮(nitric oxide, NO)、诱导型一氧化氮合酶(inducible NO synthase, iNOS)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、caspase-1以及其它促炎因子是导致神经元细胞死亡的原因[2-4]。这些炎症因子对神经元可以产生强烈的毒性作用，最终导致神经元变性坏死。因此抑制小胶质细胞的过度活化是目前防治神经退行性疾病的一个重要策略。

近年来，Wang等[5]发现一种新型的在体外具有抗炎活性的NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)家族成员PYNOD。它由PYD结构域和NOD结构域组成，与该家族的其它成员不同，PYNOD的C末端缺乏作为配体识别区域的富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)，也称NOD8[6-7]、 NLRP10、NALP10、CLR11.1或PAN5[5，8]。通过对PYNOD和炎症相关因子构建重组质粒，研究其相互间的作用发现，PYNOD有抑制由caspase-1介导的IL-1β分泌的作用，这是NLRs家族中首个被发现的对炎症起负调节作用的成员。但PYNOD在神经炎症中所发挥的作用尚不清楚。本研究观察PYNOD在LPS激活的BV2小胶质细胞中的抗炎作用。

材 料 和 方 法

1 材料

BV2细胞和质粒pEGFP-C2由本室保存；pEGFP-C2-PYNOD重组质粒由本实验室前期构建；大肠杆菌E.coliDH5α购自北京天根生化科技有限公司；细胞转染所用的阳离子聚合物JetPeiTM为Polyplus产品；细胞培养基DMEM和胎牛血清为Gibco产品；胰蛋白酶购自Hyclone；逆转录试剂盒购自TaKaRa；二甲基亚砜(DMSO)和LPS为Sigma产品；中分子蛋白Marker为Fermentas产品；Griess试剂盒购自Promega；所有抗体均购自CST；小鼠IL-1β ELISA试剂盒购自R&D；BCA法蛋白定量试剂盒购自上海申能博彩公司；硝酸纤维素膜为Millipore产品。

2 实验方法

2.1MTT法检测细胞活力 将BV2细胞以1×104/well 铺于96孔板，每组设4个复孔，并设与实验平行的本底对照孔。细胞长满78%～80%后转染PYNOD重组质粒，孵育24 h，每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培养箱内孵育4 h，弃孔内液体，加入150 μL DMSO振荡10 min，待蓝色颗粒完全溶解后，在全自动酶标仪上检测570 nm处的吸光度(A)，以此定量反映细胞的活力。细胞活力=(加药组A值-不加细胞组A值)/(对照组A值-不加细胞组A值)×100%。

2.2分组和给药 用含10% 的胎牛血清的DMEM高糖培养基培养BV2细胞，0.25%胰酶消化BV2细胞，根据实验要求，以6×104/well 密度接种在24孔细胞培养板上，实验分组如下：正常对照组(negtive control)；脂多糖组(LPS, 1 mg/L)； PYNOD低量转染组：0.1 μg PYNOD转染24 h后，给予1 mg/L LPS刺激； PYNOD中量转染组：0.5 μg PYNOD转染24 h后，给予1 mg/L LPS刺激； PYNOD高量转染组：1.0 μg PYNOD转染24 h后，给予1 mg/L LPS刺激。

2.3Griess法测定NO含量 根据NO溶解于水后可以形成亚硝酸盐的原理，测定培养基中亚硝酸盐(NO2-)的含量，可以间接反应细胞上清中NO的含量。将BV2细胞以6×104/well 密度接种在24孔细胞培养板上，贴壁过夜后，转染处理。LPS 刺激24 h 后对NO2-进行浓度的测定。具体操作步骤如下，实验前将试剂A、 B从4 ℃冰箱中取出，放置在室温平衡30 min。亚硝酸盐(nitrite)标准品梯度稀释(100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.56 μmol/L)，用来制作标准曲线。将稀释的标准品以及待测样本细胞上清液(均设3个复孔)各50 μL，加入 96孔板中，然后加入A溶液50 μL，室温避光孵育10 min，再加入B溶液50 μL，室温避光孵育10 min后，于30 min 内用酶标仪在550 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中NO2-含量。

2.4Real-time PCR检测 iNOS和IL-1βmRNA的表达 参照GenBank上小鼠iNOS和IL-1β基因的公布序列，用引物设计软件Primer 5.0对其进行引物设计。设计上、下游引物，同时以扩增GAPDH作为内参照，由上海英骏生物公司合成。具体的引物序列见表1。

表1 引物序列

按实验分组培养细胞，37 ℃、5% CO2中培养24 h。收集细胞提取RNA并鉴定纯度；按逆转录试剂盒说明书逆转录RNA。Real-time PCR反应体系如下：cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物(10 mol/L)各 0.4 μL，加RNase-Free H2O 至20 μL混匀。反应条件为：95 ℃10 s； 95 ℃30 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 个循环；于每个循环的72 ℃ 10 s末收集1次荧光信号，循环结束后执行收集熔解曲线程序。各梯度浓度的相对标准品均设3 个平行管，反应完毕后用荧光定量分析软件进行自动绘制扩增曲线以及熔解曲线，通过对熔解曲线的分析来检测产物特异性。建立标准曲线后，可对各受试样本的相对定量值进行检测。

2.5Western blotting 检测iNOS的蛋白水平 按实验分组培养细胞，37 ℃、5% CO2培养， LPS刺激24 h后提取细胞总蛋白，操作步骤见下：弃培养液，用预冷的PBS 清洗3 次，每孔加 200 μL 细胞裂解液，冰上裂解 30 min，800 r/min，4 ℃离心5 min， 取上清， BCA 法蛋白定量。10% SDS- PAGE 分离蛋白， 半干法转至 PVDF 膜。室温下用封闭液封闭 2 h 后分别加入iNOS(1∶1000)和 GAPDH(1∶1000)抗体， 4 ℃孵育过夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min。将PVDF膜放于按1∶5000用TBST稀释的HRP标记的羊抗小鼠II抗，室温缓慢振荡1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。 将Western blotting 化学荧光试剂A、B 各300 μL 等量混合后，冲洗PVDF膜5 min后，于暗房中X 光片曝光，扫描仪扫描Western blotting图像，Gel-pro Analyzer 4.5软件分析Western blotting条带的灰度。

2.6ELISA法测定BV2细胞中IL-1β的含量 按上述分组培养细胞，37 ℃、5% CO2培养24 h；取出96孔培养板，4 ℃离心，200×g离心15 min，将每孔上清移至200 μL 灭菌离心管中，置-80 ℃保存备用。试剂盒从冰箱中取出后置室温下复温，双蒸水稀释浓缩的洗涤液(1∶20)。将标准品成比稀释为所需的浓度。在使用前的30 min，按1∶100比列将试剂盒中提供的浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物分别稀释为生物素化抗体工作液和酶结合物工作液，使用前30 min准备。将细胞上清液样本提前从-80 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱中，临用平衡于室温。实验具体步骤参见R&D ELISA试剂盒说明书。计算每一种样品3个复孔A值的平均值，将该值代入上述由标准品得到的直线回归方程中，计算出细胞培养上清液中样品的含量。

3 统计学处理

所有结果以SPSS 11.0软件处理，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，数据比均采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染重组质粒pEGFP-C2-PYNOD对BV2细胞活力的影响

如图1，结果提示 0.1～1 ng重组质粒pEGFP-C2-PYNOD作用BV2小胶质细胞 24 h 后，不影响小胶质细胞活力，与空白对照组相比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。

Figure 1. The effect of pEGFP-C2-PYNOD on the activity of BV2 cells. Mean±SD. n=3.

2 PYNOD抑制LPS激活的BV2细胞释放NO

活化的小胶质细胞能释放NO参与神经炎性损伤，为了分析PYNOD抑制NO释放的作用，采用Griess试剂间接检测细胞上清中NO。结果见图2，单独转染pEGFP-C2和pEGFP-C2-PYNOD质粒组有少量NO释放，单纯给予LPS刺激组的细胞释放的NO量显著升高，转染不同量pEGFP-C2-PYNOD 的质粒组中，NO的释放呈现剂量依赖效应；其中0.5 μg和1.0 μg的pEGFP-C2-PYNOD转染组NO的释放量分别降至27 μmol/L和15 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示PYNOD对LPS激活的BV2细胞释放NO有显著抑制作用。

Figure 2. Inhibitory effect of PYNOD on the release of NO in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

3 PYNOD下调LPS 诱导小胶质细胞iNOS的 mRNA 表达

由图 3可见，空质粒组及PYNOD单独处理组与 LPS 组相比较，iNOS的 mRNA 几乎没有表达。而各PYNOD转染组不同程度地降低了LPS诱导小胶质细胞iNOS mRNA 表达，呈现一定剂量依赖效应。0.1 μg PYNOD转染组iNOS mRNA的表达量与LPS 组相比较无显著差异,而0.5 μg和1.0 μg PYNOD转染组iNOS mRNA 表达量分别为LPS 组的(52.5±2.5)%和(34.3±3.2)%，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果提示PYNOD能在 mRNA 水平抑制LPS 诱导的iNOS表达。

Figure 3. Down-regulation effect of PYNOD on the expression of iNOS mRNA in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LPS alone.

4 PYNOD对LPS激活小胶质细胞表达IL-1β mRNA的影响

通过实时荧光定量PCR 方法观察PYNOD对IL-1β 转录水平的影响，正常组及PYNOD单独处理组与LPS 组相比较，IL-1β 的mRNA 有少量表达，分为LPS 组的(10.5±2.1)% 和(8.3±3.4 )% ，0.1 μg PYNOD转染组IL-1β mRNA表达量与LPS 组相比较无显著差异,而0.5和1.0 μg各PYNOD转染组对LPS 诱导BV2细胞IL-1β mRNA 生成，出现明显的抑制作用，表达量与 LPS 组相比较，分别为其表达量的(55.9±6.1)% 和(38.7±4.0)%，差异有统计学差异(P<0.05)。结果提示PYNOD可在mRNA 水平抑制LPS 激活BV2细胞表达IL-1β，见图4。

5 PYNOD下调LPS激活的BV2细胞iNOS蛋白的表达

iNOS 是合成NO 的关键酶，其蛋白表达量与炎症介质NO 的生成呈正相关，本实验采用Western blotting观察PYNOD对LPS激活的BV2细胞iNOS 蛋白表达的影响。单纯LPS刺激组，经 LPS 刺激后24 h，iNOS 的表达显著升高，而经 0.1～1.0 μg PYNOD转染组的BV2细胞，LPS 诱导的iNOS 表达量明显降低，呈现剂量依赖效应的下降，该结果提示PYNOD在蛋白水平可显著抑制LPS激活的BV2细胞表达iNOS，见图5。

Figure 4. The inhibitory effect of PYNOD on the expression of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

Figure 5. PYNOD suppressed the production of iNOS protein in LPS-induced BV2 cells.

6 PYNOD下调LPS激活的BV2细胞IL-1β蛋白的表达

单纯LPS刺激BV2细胞24 h 后，IL-1β浓度可达到551.5 ng/L，空白对照组为48.2 ng/L，各PYNOD转染组均对IL-1β的分泌起到了不同程度的降低作用，呈现一定的剂量依赖效应。其中0.1、0.5 μg和1.0 μg PYNOD转染组IL-1β的浓度分别降至442.0 ng/L、340.6 ng/L和250.3 ng/L，与LPS单独处理组相比，差异有统计学意义(P< 0.05)。以上结果提示PYNOD可下调LPS 激活的BV2细胞IL-1β蛋白的表达，见图6。

Figure 6. PYNOD decreased the release of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

讨 论

脑内活化小胶质细胞是引发神经炎症的重要发病机制之一。作为脑内最主要的免疫细胞，小胶质细胞游走于整个脑组织中，发挥着免疫防御的功能，确保脑组织能够正常的行使生理功能，当Aβ蛋白、LPS或IFN-γ等刺激小胶质细胞后[9-10]，活化的小胶质细胞通过分泌一系列的炎症介质(其中包括NO、IL-1β、TNF-α、PGE2、活性氧、IL-6等)和神经毒性物质导致神经元损伤[11-12]。近年来，随着研究的不断深入，通过抑制小胶质细胞的活化来缓解神经炎症，成为研究者所关注的焦点。

NO 的合成由3种同工酶催化：iNOS、神经型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)。由nNOS和eNOS产生的NO只能持续作用几分钟，而由细胞因子及内毒素等诱导产生的iNOS催化生成的NO能够持续作用数小时[13]。目前研究认为在病理情况下，中枢神经系统炎症中反应性小胶质细胞过度表达iNOS合成大量的毒性氧自由基NO，它是造成神经元损伤的重要原因[14-15]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式[16-17]，是一种调节蛋白，在炎症和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。其中小胶质细胞和巨噬细胞被认为是IL-1β最主要的来源[18]。神经系统变性疾病如AD、PD和MS等，它们的发病机制都与IL-1β的上调密切相关[19-20]。

本实验选取LPS活化BV2小胶质细胞为实验模型，研究PYNOD对LPS活化的BV2小胶质细胞释放炎症产物的影响。通过实验发现，转染PYNOD 0.5 μg和1.0 μg后，可以抑制LPS激活的小胶质细胞炎症因子NO的释放，并呈现剂量依赖效应。实时荧光定量PCR实验证实PYNOD可抑制iNOS和IL-1β 的mRNA表达，差异有统计学意义。Western blotting实验证实PYNOD可下调iNOS蛋白的表达，结果表明转染0.5～1.0 μg PYNOD重组质粒对iNOS mRNA和蛋白表达的抑制作用呈一定剂量依赖关系。

本实验首次发现上调BV2细胞中PYNOD的表达，可通过抑制iNOS 的mRNA和蛋白表达呈剂量依赖方式减轻LPS诱导的NO的生成。PYNOD还可抑制促炎症因子IL-1β在转录水平和蛋白水平的表达。此外，本实验表明转染进入BV2细胞的PYNOD在发挥减轻炎症反应的同时对细胞本身无明显的毒性作用。以上结果表明PYNOD有可能在伴有小胶质细胞活化的神经变性疾病的治疗中发挥重要作用，具有重要的潜在价值。

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