通过富集母血浆中胎儿游离DNA无创性产前诊断β地中海贫血*

王青青， 张 媛， 章 钧， 郝秀兰， 侯红瑛

(中山大学附属第三医院妇产科，广东 广州 510630)

利用母血浆中胎儿游离DNA，对胎儿单基因遗传病进行无创性产前诊断，是目前产前诊断领域中的研究热点。但是，胎儿游离DNA存在于一个大的母体背景DNA中，在妊娠母体外周血中含量非常少，是目前产前诊断领域研究所面临的一个瓶颈问题。为解决这一瓶颈问题， 2008年Li等[1]首次报道了低变性温度共扩增PCR(co-amplicationatlowerdenaturationtemperaturePCR，COLD-PCR)技术，其可以在大量野生型基因背景中优先扩增少量突变基因，为利用母血浆胎儿游离DNA进行无创性产前诊断单基因遗传病提供了新的技术；2012年Castellanos-Rizaldos等[2]在COLD-PCR技术基础上进行了改进，首次报道了耐受温度-低变性温度共扩增PCR(temperature-tolerantco-amplicationatlowerdenaturationtemperaturePCR，TT-COLD-PCR)技术，降低了COLD-PCR的实验难度，使COLD-PCR技术更有利于用于临床。该技术共包括2种形式：快速耐受温度-低变性温度共扩增PCR(temperature-tolerantfastCOLD-PCR,TT-FAST-COLD-PCR)技术及完全耐受温度-低变性温度共扩增PCR(temperature-tolerantfullCOLD-PCR，TT-FULL-COLD-PCR)技术[1]，目前该技术仅被用于富集外周血中肿瘤来源的游离DNA突变，在无创性产前诊断方面的应用尚无报道[3]。

本研究以广东地区最常见的单基因遗传病β地中海贫血IVS-II-654型及CD41-42型作为切入点进行研究，通过检测母血浆中胎儿游离DNA突变，拟建立一种简便、高效的可富集母血浆中胎儿游离DNA突变的实验平台，评价其在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA突变的适用范围。

材 料 和 方 法

1 材 料

1.1临床资料 第一阶段选取2012年3月～2012年9月就诊于中山大学附属第三医院产科门诊及产科实验室的20例β地中海贫血(其中IVS-II-654型9例及CD41-42型11例)患者外周血标本；第二阶段选取2012年3月～2013年2月就诊于中山大学附属第三医院产科实验室的4对均为β地中海贫血的夫妇外周血标本，见表1；所有外周血标本均使用血常规管(EDTA抗凝)，抽取数量为8mL；夫妇双方β地中海贫血基因类型均于我院产科实验室通过基因测序技术确诊。本研究严格按照中国医学伦理委员会的要求，已征得所有研究对象的知情同意，并均已签署知情同意书。

表1 4例夫妇双方β地中海贫血基因类型

1.2羊水细胞培养结果对照 对上述4例孕妇，于抽血前实施羊膜腔穿刺术抽取羊水细胞标本，所有羊水细胞标本基因类型均通过基因测序技术确诊，胎儿基因型以此检测结果作为金标准进行对照。

2 方法

2.1外周血DNA的提取 取EDTA抗凝的外周血2mL，混匀后取200μL用于提取DNA。采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen)，按照说明书操作提取DNA。使用pH为8.0的TE缓冲液将DNA稀释至终浓度为100mg/L。

2.2单核苷酸多态性位点 使用Haploview软件，对HBB基因进行SNP与单倍型分析，检索HBB基因内杂合度较高的SNP位点；检测收集样本中与IVS-II-654位点及CD-41-42位点连锁的SNP位点。

2.3TT-COLD-PCR技术 引物序列信息见表2。本研究所选试剂均由Invitrogen公司提供，总反应体系为25μL：2.5μL10×PCRBuffer(不含Mg2+)；0.75μLMgCl2；1.0μLPCR引物(0.4μmol/L)；1.5μLDNA模板；18.55μLddH2O；0.2μLPlatimumTapDNAPolymerase。

表2 TT-COLD-PCR引物序列

2.4父源性β地贫为IVS-II-654型及CD41-42型分析 孕妇外周血分别利用 TT-FAST-COLD-PCR及TT-FULL-COLD-PCR技术，其反应循环条件分别如下： (1)95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；循环25次；75.7 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.0 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.3 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.6 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.9 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；70 ℃延伸7 min；产物于4 ℃条件下保存。(2)95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循环25次；95 ℃变性30 s；70 ℃复性5 min；83.5 ℃变性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃变性30 s；70 ℃复性5 min；84.0 ℃变性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃变性30 s；70 ℃复性5 min；84.5 ℃变性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃变性30 s；70 ℃复性5 min；85.0 ℃变性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min；产物于4 ℃条件下保存。扩增后的产物送上海英俊生物技术有限公司测序。

2.5普通PCR技术 引物序列同TT-COLD-PCR技术。反应体系配置同TT-COLD-PCR技术。反应循环条件：95 ℃预变性5min；95 ℃变性30s，60 ℃退火30s，72 ℃退火30s；循环40次；72 ℃延伸7min；产物于4 ℃条件下保存。扩增后的产物送上海英俊生物技术有限公司测序。

结 果

1 单核苷酸多态性位点

在本研究中对收集的20例β地贫患者进行测序，结果发现9例IVS-II-654型β地中海贫血与rs7480526位点连锁，11例CD41-42型β地中海贫血与rs10768683位点连锁：图1A表示与IVS-II-654位点连锁的SNP位点rs7480526，其碱基类型为A/C；图1B与图1C表示SNP位点rs7480526中A碱基与野生型IVS-II-654位点G碱基连锁；图1D与图1E表示SNP位点rs7480526中C碱基与突变型IVS-II-654位点A碱基连锁；图2A表示与CD41-42位点连锁的SNP位点rs10768683，其碱基类型为G/C；图2B与图2C表示SNP位点rs10768683中G碱基与野生型CD41-42位点TTCT四个碱基连锁；图2D与图2E表示SNP位点rs107686831中C碱基与突变型CD41-42位点碱基连锁(其中，黑色箭头表示CD41-42发生移码突变的位置)。

2 TT-FAST-COLD-PCR、TT-FULL-COLD-PCR及普通PCR技术检测4例孕妇外周血标本

利用TT-FAST-COLD-PCR技术检测父源性β地中海贫血基因类型为IVS-II-654型的2例孕妇外周血标本，其中1例可明显扩增出父源性致病突变基因(A碱基)，见图3；另外1例未直接检测到父源性致病突变基因，但检测到与其连锁的rs7480526位点(C碱基)，与羊水细胞培养检测结果一致，检出率为100%。利用TT-FULL-COLD-PCR技术检测父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42的2例孕妇外周血标本，均可明显扩增出父源性致病突变基因(以扩增出发生移码突变后的碱基序列作为依据)，见图4。AGG 3个碱基为发生TTCT移码突变后最先扩增到的3个碱基序列，与羊水细胞培养检测结果一致，检出率为100%。利用普通PCR技术检测父源性β地中海贫血基因类型为IVS-II-654型的2例孕妇外周血标本，只检测到IVS-II-654野生型位点，未检测到其突变型位点，见图5。利用普通PCR技术检测父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42的2例孕妇外周血标本，只检测到CD41-42野生型位点，未检测到其突变型位点，见图6。

3 金标准对照

图7为利用羊水细胞培养标本通过测序检测出胎儿1及胎儿2的β地中海贫血基因类型(IVS-II-654型)，其碱基突变类型为G碱基突变为A碱基；图8为胎儿3及胎儿4的β地中海贫血基因类型(CD41-42型)，其碱基突变类型为TTCT 4个碱基缺失导致的移码突变。

Figure 1. The SNP was associated with IVS-II-654. a: the SNP rs7480526 (A/C). Black arrow: A base; blue arrow: C base. b: the SNP rs7480526 (A) was linked to the wild type of IVS-II-654. Black arrow: A base. c: the wild type of IVS-II-654 was linked to the rs7480526 (A). Red arrow: G base. d: the SNP rs7480526 (C) was linked to the mutant type of IVS-II-654. Black arrow: C base. e: the mutant type of IVS-II-654 was linked to the rs7480526(C). Red arrow: A base.

讨 论

1997年香港中文大学Lo等[4]首次证实了母体血浆中胎儿游离DNA的存在，为无创性产前诊断开辟了新的途径。利用母血浆胎儿游离DNA无创性产前诊断胎儿单基因遗传病是目前产前诊断领域的研究热点；然而，由于母血浆中胎儿游离DNA含量相对很少，母源性游离DNA占绝对优势，利用传统的PCR技术则会干扰胎儿来源游离DNA的扩增，因此难以准确对胎儿单基因遗传病进行无创性产前诊断，这是当前研究所面临的瓶颈问题。

2008年，Li等[1]首次报道了COLD-PCR技术，该技术利用异源双链与同源双链之间变性温度的差异，可以在大量野生型基因背景中优先富集特定类型的少量DNA突变；由于对异源双链临界变性温度(critical denaturation temperature，Tc)值的要求较高，在实验中需要对各种等位基因解链温度(melting temperature，Tm)值测定的基础上反复优化实验条件才能确定，反应体系的配置、PCR扩增仪孔间试剂温度、PCR仪温度上升的速度等[2]都会对其造成影响，因此增加了实验难度。2012年Castellanos-Rizaldos等[2]在COLD-PCR技术基础上进行了改良，首次报道了TT-COLD-PCR技术，其根据碱基突变或缺失类型，将异源双链的变性温度限制于一个特定温度范围内，在此温度范围内进行PCR扩增时会大大提高扩增效率并降低实验难度。

Figure 2. The SNP was associated with CD41-42. a: the SNP rs10768683 (G/C). Black arrow: G base; red arrow: C base. b: the SNP rs10768683 (G) was linked to the wild type of CD41-42. Red arrow: G base. c: the wild type of CD41-42 was linked to the rs10768683 (G). Black arrow: TTCT bases. d: the SNP rs10768683 (C) was linked to the mutant type of CD41-42. Red arrow: C base. e: the mutant type of CD41-42 was linked to the rs10768683 (C). Black arrow: the location of the frame shift mutations (TTCT).

Figure 3. TT-FAST-COLD-PCR thermocycling program enriched mutations in IVS-II-654 (G>A) in HBB gene. Red arrow： G base was the wild type of IVS-II-654; black arrow: A base was the mutant type of IVS-II-654.

Figure 4. TT-FULL-COLD-PCR thermocycing program enriched mutations in CD41-42 (ΔTTCT) in HBB gene . Black arrow: the TTCT four bases were the wild type of CD41-42; red arrow: the AGG bases were the firstly amplified three bases when the TTCT bases were missed.

Figure 5. Conventional-PCR thermocycling program enriched mutations in IVS-II-654 (G>A) in HBB gene . Red arrow: G base was the wild type of IVS-II-654.

Figure 6. Conventional-PCR thermocycling program enriched mutations in CD41-42 (ΔTCTT ) in HBB gene .Black arrow: the TTCT four bases were the wild type of CD41-42.

Figure 7. The fetal gene type of β-thalassemia of the first and second cases.Black arrow: A base was the mutant type of IVS-II-654.

Figure 8. The fetal gene type of thalassemia of the third and fourth cases. Black arrow: the location of the frame shift mutations (TTCT) was the mutant type of CD41-42.

该技术共包括2种形式，分别为TT-FAST-COLD-PCR技术及TT-FULL-COLD-PCR技术,其中，TT-FAST-COLD-PCR技术只适用于当点突变(例如：G∶C>A∶T或者G∶C>T∶A)导致DNA双链Tm值降低时，对于点突变或者碱基缺失导致DNA双链Tm值无变化或者升高，则不能利用此技术进行扩增；TT-FULL-COLD-PCR技术适用于扩增对于碱基突变导致DNA双链的Tm值降低、不变或者升高的类型，具有可以扩增所有已知突变及未知突变的优点；但是，由于在TT-FULL-COLD-PCR技术中增加了异源双链形成温度这一步骤，故PCR循环时间较长[5]，对DNA聚合酶的影响较大，使富集效果受到影响；与TT-FULL-COLD-PCR相比，时间更快且扩增效率更高。

目前国内外报道的关于无创性产前诊断单基因遗传病的技术或方法包括凝胶电泳大小分离法、全基因组扩增法[6]和肽核酸钳技术[7]等均分别存在灵敏度差、通用性差、成本高和无法在临床上推广等局限性。本研究以本地区最常见的单基因遗传病β地贫(IVS-II-654型及CD41-42型)的无创性产前诊断作为切入点，选取夫妇双方为不同β地贫血基因类型的病例进行研究：由于IVS-II-654型β地贫点突变类型为C>T或G>A，突变型DNA双链的Tm值小于野生型DNA双链的Tm值，而CD41-42型β地贫突变类型为TCTT或者TTCT4个碱基缺失导致的移码突变，突变型DNA双链的Tm值大于野生型DNA双链的Tm值，而根据不同形式TT-COLD-PCR技术原理：对于父源性β地贫基因类型为IVS-II-654者，利用TT-FAST-COLD-PCR技术，其中1例直接予孕妇外周血中直接扩增出父源性β地贫致病突变基因，而另外1例未直接扩增出父源性β地贫致病突变基因，对于此病例，本研究则选择扩增与父源性β地贫基因连锁的SNP位点的方法，来降低检测的阴性率；对于父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42型者，我们则利用TT-FULL-COLD-PCR技术对孕妇外周血中胎儿游离DNA进行扩增，直接扩增出了父源性β地中海贫血基因，表示胎儿遗传了父源性β地贫致病突变基因，具有介入性产前诊断指征。利用SNPs进行无创性产前诊断具有以下优点：(1)在孕妇外周血中若未直接检测到父源性致病突变基因，则可以通过检测与父源性等位基因连锁的SNP位点，降低检测阴性率；(2)如果夫妇双方均具有相同等位基因时，可以利用夫妇双方具有不同的SNPs来进行区分；(3)检测结果可以使用SNPs来进行进一步确认。对于父源性致病突变基因及与父源性等位基因连锁的SNP位点均未扩增出者，则代表胎儿未遗传父源性致病突变基因，对于这一部分孕妇，则免受介入性产前诊断的痛苦，从而降低了介入性产前诊断的比例。

为了观察TT-COLD-PCR技术对少量突变基因的扩增效率，我们同时对上述标本进行了普通PCR技术扩增，扩增后产物测序结果表明：利用TT-FAST-COLD-PCR技术可以优先、有效富集IVS-II-654型少量突变基因，其富集效率可提高10～15倍左右；利用TT-FULL-COLD-PCR技术可以优先、有效富集CD41-42型少量突变基因，富集效率可提高2～5倍。

综上所述，本研究建立了一种简便、高效的可富集母血浆中胎儿游离DNA突变的实验平台，并且利用同时检测父源性致病突变基因及与父源性等位基因连锁的SNP位点的方法[8]，拓展了检测范围从而降低了检测的假阴性率，可用于无创性产前诊断单基因遗传病。

[参 考 文 献]

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