骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤炎症反应的抑制作用*

赵 雷， 冯业童， 董 超， 周余来， 刘朋飞△

(1暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院麻醉科，广东 深圳 518020； 2吉林大学药学院再生医学系，吉林 长春 130021)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床常见肾脏疾病，该疾病发病率在普通人群中约为0.5%～1%，在住院患者中增长为2%～7%，而在ICU及术后患者中为4%～25%，在上述这些人群中，死亡率为28%～90%[1-2]。随着医疗技术的发展，人类的许多疾病均得到了有效控制，但是至今尚未发展出对AKI的有效治疗方法，该疾病相关的死亡率也没有得到明显改善，其发病率甚至有逐年增高的趋势。近年来的研究表明，氧自由基损伤及并发的一系列炎症反应可能与AKI有重要的联系，因此，如何降低AKI中的氧自由基和某些炎症介质造成的损伤成为了现阶段人们的研究重点[3-5]。

骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中存在的一类成体干细胞，具有多向分化潜能，而且在体外增殖能力强，性能稳定，目前，研究人员已经证实BMSCs在肾衰竭治疗方面有着重要的作用[6-8]；维生素E是一种脂溶性维生素，在众多种类的维生素中，维生素E是最主要的抗氧化剂之一，因为氧自由基升高是导致肾细胞损伤的重要机制之一，所以，维生素E对急性肾衰竭也有一定的治疗治疗效果[9-10]。本课题组已经证实BMSCs联合维生素E对AKI具有一定的治疗作用，而且治疗效果优于单一的治疗模式，但是，相关治疗机制尚不明确[11]。在本课题中，从炎症蛋白抑制的角度进一步分析治疗机制，评价治疗效果，从而进一步促进这种联合治疗模式在临床肾脏疾病治疗方面的应用。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级Wistar大鼠，雄性，体重250～310 g，由吉林大学白求恩医学院动物中心提供。动物许可证号为SCXK-(吉)2007-0003。

2 主要试剂和仪器

DMEM/F12培养基及胎牛血清购自Gibco；Percoll分离液购自Pharmacia；维生素E购自Sigma；Trizol RNA提取液购自Invitrogen；RNA反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)、白细胞介素-10(interleukin 10，IL-10)以及巨噬细胞炎症蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)ELISA试剂盒均购自ASSAY；IX-70倒置相差显微镜及正置生物学显微镜均购自Olympus；EXL-808酶标检测仪购自美国宝特公司；PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司；real-time Quality PCR仪购自MJ Research。

3 方法

3.1大鼠BMSCs的分离培养 从雄性Wistar大鼠的股骨和胫骨中分离骨髓，并进一步用1 073 g/L的Percoll分离液分离骨髓中的BMSCs，用含10 %胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，于37 ℃、5 % CO2培养箱内培养。采用流式细胞术对BMSCs的特异蛋白的表达进行鉴定，同时，利用成骨分化培养基和成脂分化培养基诱导BMSCs定向分化，结果表明所获得的BMSCs具有正常的间充质细胞表型，而且具有向成骨和成脂方向分化的潜能，具体鉴定结果可参考本课题组前期文章[11]。

3.2大鼠AKI动物模型的制备与治疗 实验动物共分6组，即空白对照组、造模组、造模+阳性药物组、造模+维生素E组、造模+BMSCs组和造模+BMSC+维生素E组，每组6只大鼠。造模时大鼠每天给予腹腔注射庆大霉素140mg/kg，连续注射6d，造模结束后第1天开始进行治疗。本研究的阳性药物选用地塞米松，剂量为每天0.08mg/kg，维生素E剂量为每天80mg/kg，BMSCs剂量为每天每只大鼠1×106cells，均为尾静脉注射，空白对照组和模型组给予等量溶剂，此阶段各个实验组均连续注射6d。

3.3炎症蛋白mRNA表达水平检测 治疗结束后第1天，处死各组实验动物，收集每组肾脏组织，各取40 mg的肾脏组织用1 mL Trizol 裂解液裂解，提取RNA后，通过反转录试剂盒进行反转，并以反转后的cDNA为底物，进行实时荧光定量PCR的操作，具体的反转录PCR和实时荧光定量PCR操作过程及反应程序均按试剂盒说明书进行，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR实验的引物

3.4炎症介质的蛋白表达水平检测 在治疗结束后，收集各实验组大鼠血液，离心后分离血浆成分，用于炎症蛋白的分析。同时，收集各实验组的肾脏组织，每组取0.2 g 肾脏组织用于组织研磨，离心后进一步收集组织研磨液，用于检测炎症蛋白。通过ELISA法从蛋白水平评价各实验组血浆和肾脏组织中炎症蛋白的表达量，具体的操作过程按ELISA试剂盒操作说明进行。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 17.0软件分析，各组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BMSCs的分离培养结果

采用密度梯度离心法分离的大鼠BMSCs，用含血清的DMEM/F12培养基进行培养，可以见到分离培养24 h后，细胞呈长梭形贴壁生长(图1A)。随着培养时间的延长，可以见到细胞的生长密度逐渐增大(图1B)，一般4～6 d后，即可见到细胞的密集生长状态(图1C)。由此可见，本研究分离的大鼠BMSCs具有一定的体外增殖能力。

2 炎症蛋白基因在肾脏组织中的表达结果

单一的维生素E不能显著改变MCP-1和IL-10的表达，但是对于RANTES以及MIP-2的表达具有一定的抑制作用；另外，经过阳性药物、BMSCs以及BMSCs联合维生素E治疗后，各种炎症蛋白均有不同程度的下降，而且BMSCs联合维生素E治疗对RANTES以及MIP-2的抑制作用要明显优于干细胞或维生素E单一治疗组，见图2。

Figure 1. The morphological characteristics of BMSCs. A: BMSCs cultured for 24 h; B: BMSCs cultured for 96 h; C: BMSCs cultured for 120 h. Scale bar = 200 μm.

Figure 2. The mRNA expression of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

3 各实验组血浆中炎症蛋白的含量变化

结果显示，AKI大鼠血浆中的炎症蛋白显著增加；随着治疗的进行，除IL-10以外，各实验组炎症蛋白含量均有一定程度的下降，但是下降程度普遍较小，而且，维生素E组未见显著疗效；在MIP-2的调控方面，BMSCs联合维生素E体现出最佳抑制效果，见图3。

4 各实验组肾脏中炎症蛋白的含量变化

对肾脏组织中的炎症蛋白相对含量的检测结果可见，各实验组的变化趋势与实时定量PCR的检测趋势基本一致，但也略有不同。单一维生素E治疗仅对MCP-1和MIP-2有一定的降低作用，而对于IL-10和RANTES没有明显作用。阳性药物对于MIP-2的表达水平没有明显影响，这一结果与实时定量PCR中的结果一致。同时，BMSCs联合维生素E进行治疗对肾脏组织的RANTES以及MIP-2的调控存在抑制作用，也明显优于干细胞或维生素E的单一治疗，见图4。

Figure 3. The protein levels of inflammatory proteins in the plasma of each group.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

Figure 4. The protein levels of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

讨 论

本课题从炎症蛋白抑制的角度，进一步评价BMSCs联合维生素E对AKI的治疗效果，分别检测了血浆和肾脏组织中的MCP-1、IL-10、RANTES和MIP-2的表达水平，其中MCP-1、RANTES和MIP-2均属于正性炎症蛋白分子，即增强炎细胞活性作用，而IL-10则属于负性炎症蛋白分子，即抑制炎细胞活性作用。随着炎症反应程度的增强，正性炎症蛋白分子的表达量会逐渐升高，由于机体的代偿作用，负性炎症蛋白分子也会随之上调。在经过一系列治疗后，炎症反应得到缓解，正性炎症蛋白分子的表达量也会逐渐下降，同时，负性炎症蛋白分子在达到一定程度后也会逐渐下降，恢复到正常水平。所以，正性炎症蛋白分子与负性炎症蛋白分子在本研究中体现了较为相似的变化趋势。

在本课题中，选取地塞米松作为阳性药物对急性肾损伤进行治疗，而且取得了一定疗效。作为一种糖皮质激素，地塞米松被广泛用于肾损伤的临床治疗。在基础医学研究方面，地塞米松也可用于多种类型肾损伤(缺血再灌注损伤、环孢素A肾毒性损伤、硝酸双氧铀损伤和庆大霉素损伤等)的治疗，而且均取得了一定疗效[12]。所以，本课题选用地塞米松作为阳性药物，虽然与造模组相比发挥了一定的治疗效果，对某些炎症蛋白分子有一定的调控作用，但地塞米松并非对所有的炎性蛋白都具有调节作用，本课题中，该药物对肾脏组织中的MIP-2没有明显的调控作用，而对血浆中的MIP-2有一定的调节。

维生素E作为一种抗氧化剂，对氧自由基造成的损伤具有较强的保护作用，但是并不能直接起到抑制炎症反应的作用，所以，本课题中的维生素E治疗组在炎症抑制方面并未表现出明显的抑制作用，对很多炎症蛋白的抑制强度与其它治疗组相比，仍然具有较大的差距。BMSCs在肾损伤治疗方面的作用也被多个课题组证实[6-8,13]，而且，间充质细胞本身就具有分泌多种调控蛋白，进而抑制炎症反应的功能，所以，本课题中的BMSCs治疗组也有较好的疗效，而且，对某些炎症蛋白分子的调控作用优于阳性药物组。

目前，课题组已经证实：维生素E对BMSCs的增殖、分泌功能均无明显的影响，二者联合的优化作用可能是单独作用结果的叠加，而非二者的协同作用[11]。同时，在炎症抑制方面，维生素E只能通过抗氧自由基途径缓解肾损伤症状，对炎症反应无直接作用；而BMSCs则可以通过多种途径参与肾脏损伤修复，并可直接抑制炎症反应，缓解炎症介质导致的肾损伤。由于作用途径的不一致，BMSCs联合维生素E的治疗模式在某些炎症介质的抑制方面，效果优于单一的干细胞或维生素E的治疗模式，但是，尚无直接研究结果表明二者在炎症抑制方面存在协同作用，本文中的联合优化效果仍然可能是二者单独作用的结果，对此，尚有待进一步的验证和分析。

总的来讲，本课题从抑制炎症介质的角度，评价了BMSCs联合维生素E对AKI的治疗效果。结果表明，与单一的治疗模式相比，BMSCs联合维生素E对某些炎症蛋白具有更强的抑制效果。但是，本课题中所用干细胞和维生素E的剂量还比较单一，最佳的作用剂量和作用模式以及深入的机制仍需进一步探索和研究。

[参 考 文 献]

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