RP-HPLC法测定毛果鱼藤中美迪紫檀素的含量

吴红果，黄 威，娄华勇，梁光义，潘卫东

(1. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002; 2. 遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099; 3. 贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

毛果鱼藤 (DerriseriocarpaHow)为豆科(Leguminosae)鱼藤属(Derris)植物。主要分布在云南、广西一带，别名为土甘草、鸡血藤、藤甘草等[1]。其根入药能够补血、润肠，常用于治疗咳嗽、发烧胸闷、咽喉痛；藤茎具有镇咳化痰、利尿除湿的功效，民间常用来治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳嗽等症[2-4]。目前毛果鱼藤中已报道的化学成分有三萜、甾体、脂肪酸类化合物[5-6]，其他类型的化学成分尚未见报道。本课题组对毛果鱼藤药材的化学成分进行了系统研究，从中分离鉴定了三萜、甾体和一系列黄酮类成分，其中黄酮类化合物美迪紫檀素为其主要的化学成分，据相关文献报道，美迪紫檀素具有抗结核、抗真菌及抗肿瘤等作用[7-9]。到目前为止，毛果鱼藤中黄酮类化合物的含量测定方法尚未见报道。为了更有效的控制毛果鱼藤的质量，本文首次以美迪紫檀素作为指标性成分，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，建立了毛果鱼藤药材中美迪紫檀素的RP-HPLC含量测定方法，以期对毛果鱼藤的研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱系统(G1311A泵、G1315A DVD检测器、Agilent色谱工作站)，SG5200H超声波清洗仪(河南兄弟仪器设备有限公司)，梅特勒-托利多AL204电子天平(上海速展计量仪器有限公司)；色谱纯乙腈和甲醇为天津登科化学试剂有限公司产品，水为重蒸水并经0.45 μm水系滤膜过滤，其他试剂均为分析纯。

1.2 试药 美迪紫檀素对照品为自制，经ESI-MS、UV、IR、1H-NMR和13C-NMR鉴定为美迪紫檀素，经DVD检测器检测，峰面积归一化法计算其纯度>98%；毛果鱼藤药材采自贵州省兴义市，经贵阳市中医学院陈德媛教授鉴定为豆科鱼藤属植物毛果鱼藤DerriseriocarpaHow，样本保存在贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液 精密称取美迪紫檀素对照品2.86 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm有机系滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取样品粉末(过40目筛)约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇150 mL，密塞，称定质量，室温下冷浸30 min，超声处理120 min，取出，冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足至原质量，摇匀，0.45 μm有机系滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适应性 采用Hypersil-BDS C18色谱柱 (5 μm,250 mm×4.6 mm)，柱温为30.0 ℃，流动相为乙腈 (A)-0.1 %醋酸水溶液(B)梯度洗脱(0～30 min,20% A→40% A, 80% B→60% B)，流速为1.0 mL/min，检测波长为276 nm，进样体积为20 μL。在以上色谱条件下，美迪紫檀素对照品和毛果鱼藤样品色谱图(见图1)。

图1 毛果鱼藤样品(A)与美迪紫檀素对照品(B)的HPLC色谱图

2.3 线性关系考察 分别吸取“2.1.1”项下美迪紫檀素对照品储备液适量。分别以1、2、4、8、10、16、20 μL的进样体积注入液相色谱仪，按“2.2”色谱条件测定，以对照品进样量 (ng) 为横坐标 (X)，峰面积积分值为纵坐标 (Y)，经线性回归处理得美迪紫檀素的回归方程：Y=2.064X+5.7612，R2= 0.9992。结果表明，美迪紫檀素在0.0572～1.1440 μg范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取美迪紫檀素对照品储备液，连续进样6次，按“2.2”色谱条件测定，记录美迪紫檀素的峰面积，RSD (n = 6) 为1.70 %。说明精密度良好。

2.5 稳定性试验 按照“2.1.2”的方法配制供试液1份，在“2.2”色谱条件下，每隔4 h进样1次，每次20 μL共6次，记录美迪紫檀素的峰面积，RSD为1.55 %，数据表明供试液在24 h内基本稳定。

2.6 重复性试验 取毛果鱼藤药材1批，按“2.1.2”项下方法操作，制得6份供试液，分别进样20 μL，记录美迪紫檀素的峰面积，并计算含量。平均含量为0.002 8%，RSD为1.27%。说明该方法的重复性良好。

2.7 加样回收试验 精密称取已知含量的样品2.5 g共6份，另精密称取美迪紫檀素对照品0.085 mg。依照“2.1.2”的方法制备供试液，平行制备6份，按“2.2”色谱条件测定，记录美迪紫檀素的峰面积，计算样品含量和回收率。结果表明美迪紫檀素平均回收率为100.78 %，RSD为1.81 %(见表1)。

表1美迪紫檀素加样回收率试验

序列取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%12.50400.07010.0850.153798.3522.50350.07010.0850.154599.2932.50570.07020.0850.1582103.5342.50320.07010.0850.1564101.5352.50270.07010.0850.1563101.4162.50460.07010.0850.1556100.59100.781.81

2.8 样品含量测定 依照“2.1.2”的方法制备3个批次的供试液，每个批次平行制备3份供试液。按“2.2”色谱条件测定样品含量，记录美迪紫檀素的峰面积，含量测定结果(见表2)。

表2美迪紫檀素含量的测定

批次取样量/g峰面积含量/10-3 %平均含量/10-3 %RSD/%5.0050228.9702.7015.0011221.7682.622.671.565.0080227.1422.685.0016224.5972.6525.0048231.5992.732.701.715.0056231.4392.735.0028229.8092.7135.0037223.3552.632.651.865.0014222.2222.62

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 取供试品粉末约2 g，分别用甲醇、乙醇、乙酸乙酯为溶剂超声30 min，乙酸乙酯液蒸干后用甲醇溶解，并按上述色谱条件进行测定，结果表明以甲醇为提取溶剂时杂质峰较少。

3.2 提取方法的选择 以甲醇为溶剂，取供试品粉末约2 g，精密称定分别用超声提取和加热回流提取2种方法提取，并按上述色谱条件进行测定，结果表明用超声提取其提取率较高。

3.3 流动相的选择 分别以甲醇-水，甲醇-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %醋酸水溶液为流动相，更换流动相比例，采用等度洗脱，均不理想。采用梯度洗脱，并乙腈-0.1 %醋酸水溶液为流动相，发现美迪紫檀素与其他成分分离效果较好。

3.4 检查波长的选择 美迪紫檀素对照品溶液的3D高效液相图谱显示，其在200 nm和276 nm处有最大吸收，但200 nm处于紫外末端吸收，易导致图谱基线漂移，故选择276 nm作为检测波长。

本研究首次建立了以美迪紫檀素为指标成分的毛果鱼藤药材的RP-HPLC含量测定方法，该方法简便、准确，重复性好，可用于毛果鱼藤药材的质量控制。

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