小叶锦鸡儿内生拮抗菌株的筛选与分子鉴定

李志英 田岳娟 徐惠娟 代金霞

摘要：采用抑菌圈法对分离自宁夏荒漠草原固沙植物小叶锦鸡儿的27株内生细菌进行植物病原菌抑制能力的测定。结果表明，小叶锦鸡儿内生细菌的抑菌能力较强，多数菌株对2种以上的病原菌表现出拮抗活性，且不同菌株之间以及同一菌株对不同病原菌间的拮抗活性存在很大差异，有7株内生细菌对所有供试病原菌都表现出一定的抑制活性。通过16S rDNA序列分析发现，小叶锦鸡儿内生拮抗菌株分别与芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、中华根瘤菌属具有很高的同源性，这些菌株多数为芽孢杆菌。

关键词：小叶锦鸡儿；内生菌；抑菌活性；分子鉴定

中图分类号： Q939.92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0105-02

收稿日期：2013-09-04

基金項目：国家自然科学基金（编号：31200103）；宁夏自然科学基金（编号：NZ12152）。

作者简介：李志英（1977—），女，宁夏青铜峡人，博士，讲师，研究方向为植物分子生物学。E-mail：lizhiying_1115@163.com。

通信作者：代金霞，女，宁夏银川人，博士，副教授，研究方向为环境微生物。E-mail：djxia05@163.com。植物内生菌（endophyte）是指生长在健康植物组织、器官内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群[1]。植物内生菌长期生存于植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物体为其提供生长所必需的能量和营养，另一方面，内生菌又可以通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响[2]。许多植物内生细菌具有多方面的生物学和生态学功能，如固氮、促进植物生长、抗逆境、抗病虫害和生物修复等。

植物病害是引起植物品质下降、产量损失的主要原因之一，约80%的植物病害是由植物病原菌引起的。目前，对植物病害的主要防治手段是采用化学农药，而化学农药对人畜的副作用以及残留问题、环境污染问题已经成为农业生产中亟需解决的主要问题。植物内生菌能产生众多的抗菌产物并在一定条件下成为植物病原菌的拮抗菌，却不会引起宿主植物明显的病症，目前从植物体内筛选对植物病原菌具有抑制作用的拮抗内生菌并进行生物防治已经成为研究热点[3]。

小叶锦鸡儿（Caragana microphylia Lam.）为豆科蝶形花亚科锦鸡儿属植物，具有广泛的适应性和极强的抗逆性，是中国西北、华北、东北西部水土保持和固沙造林的重要树种之一。小叶锦鸡儿在维护干旱荒漠区的生态平衡、改善沙区环境、发展畜牧业生产、提高沙区的经济效能中发挥着十分重要的作用[4]。

本试验通过对小叶锦鸡儿内生细菌抑制植物病原菌的能力进行测定，试图筛选出具有较强抑菌活性的菌株并对其进行分子鉴定。研究结果不仅可为开发生物农药提供菌种资源，同时也将为丰富我国的微生物资源、推动干旱地区微生物资源的保护、开发和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试菌株

供试菌株分离自宁夏荒漠固沙植物小叶锦鸡儿的各部分组织中，根据培养形态选取其中的27株进行抑菌试验，菌种编号分别为：R05、R09、R10、R12、R14、R18、R41、R43、R44、R46、R47、R48、L01、L02、L05、L10、L12、L13、L15、L16、L17、L18、L19、L20、S01、S03、SD3。指示病原菌为：小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici）、番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、马铃薯干腐病菌（Fusarium solani）、萝卜黑斑病菌（Alternaria sp.），均来源于宁夏大学农学院植物病理室。

1.2内生菌的分离与纯化

各称取1 g小叶锦鸡儿的根、茎、叶，表面消毒后置于灭菌研钵中研磨；将磨碎的组织加到含有灭菌生理盐水和灭菌玻璃珠的锥形瓶中，涡旋振荡1 min；将上清液倒入灭菌离心管中沉淀后，再将上清液进行梯度稀释，稀释率分别为10-1、10-2、10-3，各取0.1 mL涂LB平板，每个处理重复3次；同时取0.1 mL最后一次冲洗的无菌水涂平板，作为表面灭菌对照。将所有平板于28 ℃培养 72 h，挑取平板上的单菌落进行划线分离，直至得到纯的单菌落并保存在斜面上备用。

1.3抑菌能力的测定

采用LB固体培养基抑菌圈法进行抑菌活性的测定。用接种环分别挑取纯化好的内生菌单菌落接入装有20 mL液体发酵培养基的锥形瓶中，于28 ℃、150 r/min恒温振荡培养 48 h，取出后用无菌水调至D值一致。将指示病原菌接入PDA液体培养基中，在28 ℃、100 r/min条件下恒温振荡培养48 h，无菌过滤后取上清备用。

采用对峙培养法，取200 μL指示病原菌滤液并用无菌玻璃棒均匀涂布于LB固体培养基上，干燥后用灭菌打孔器对称打4个孔，取35 μL内生菌发酵液滴于孔中，置于 28 ℃ 恒温培养，每处理各3个重复。从培养第1天开始观察菌落生长情况，并记录内生菌形成的透明圈直径。抑菌能力通过计算内生菌菌落形成的透明圈直径与孔直径的比值（D/d值）来评价：D/d值越大，抑菌能力越强；比值越小，抑菌能力越弱；比值为1时表示菌落无抑菌能力。

1.4菌株的分子鉴定

将筛选出的具有较强抑菌能力的菌株进行总DNA的提取。采用细菌16S rDNA的通用引物27F、1492R进行PCR扩增[5]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行16S rDNA全序列的测定，将所测序列在GenBank中进行BLAST同源性搜索，以确定菌株的分类地位。

2结果与分析

2.1小叶锦鸡儿内生细菌的抑菌活性

，分离的27株内生细菌对供试病原菌的抑菌能力差别较大，有6株内生菌对供试的所有病原菌均未表现出抑菌活性，而多数菌株对2种以上的病原菌表现出抑制活性。此外，同一菌株对不同病原菌的抑制能力也存在很大差异，如R10对番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很强，但对萝卜黑斑病菌却无抑菌活性；L17、R18对萝卜黑斑病菌表现出很强的抑制活性，但对番茄炭疽病菌的抑菌活性却很低。从整体上看，小叶锦鸡儿内生细菌的抑菌能力较强，R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株内生细菌对所有供试病原菌都表现出一定的抑制活性。

2.2内生细菌的鉴定结果

将筛选出的具有较强抑菌活性的内生菌16S rDNA序列与GenBank中的同源序列进行比较，结果表明，这些菌株分别与芽孢杆菌属（Bacillus）、類芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、中华根瘤菌属（Sinorhizobum）的细菌具有很高的同源性（表2），且多数菌株隶属于芽孢杆菌属。

小叶锦鸡儿内生细菌抑菌能力的测定结果

菌种

编号透明圈直径/孔直径（D/d值）番茄枯

萎病菌番茄炭

疽病菌玉米大

斑病菌小麦赤

霉病菌马铃薯干

腐病菌萝卜黑

斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

内生菌的16S rDNA的鉴定结果

菌株NCBI比对结果序列相似性

（%）R43，L01，L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19，R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14，R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02，L05，L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

3结论

植物体可以看作是被许多不同细菌开发的不同生境的复杂微生态系统。在植物微生态系统中，不同的内生菌可以占据不同的生态位，它们相互作用并在植物体内维持着微生态平衡。植物内生菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有广泛的应用潜力，是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源。本研究运用抑菌圈法对小叶锦鸡儿内生细菌拮抗植物病原菌的能力进行了测定，结果表明， 多数菌株对不同的病原菌均表现出一定的抑制能力。经16S rDNA序列分析表明，多数具有较强抑菌活性的菌株隶属于芽孢杆菌属。

据报道，芽孢杆菌属的一些种类对外界有害因子的抵抗力强，菌体生长过程中产生的枯草菌素、制霉菌素等多种活性物质对植物病原菌有明显的抑制作用[6]。苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis由于能产生δ内毒素，对鳞翅目等昆虫的幼虫有毒杀作用而被用以制造生物农药，是常用的生防资源菌[7]。芽孢杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属的许多菌株不仅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，从而有效促进植物的生长，而且能抑制多种病原菌的活性，从而显著提高植物的抗病性。

作为防风固沙的先锋物种，小叶锦鸡儿的生态学意义远大于其经济学意义，发掘与其共生的微生物资源不仅对探索极端环境中内生细菌-宿主植物的协同进化研究有着重要的指导意义，而且有助于我们更加透彻地认识其共生体系的形成及抗逆机理。期待能够从研究中找到增强小叶锦鸡儿抗逆性的合适途径，进而对沙漠化的治理起到积极的作用。

参考文献：

[1]Hallmann J，Quadt-Hallmann A，Mahaffee W F，et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J]. Canadian Journal of Microbiology，1997，43（10）：895-914.

[2]Kiers E T，Denison R F. Sanctions，cooperation，and the stability of plant-rhizosphere mutualisms[J]. Annual Review of Ecology，Evolution，and Systematics，2008，39：215-236.

[3]Ryan R P，Germaine K，Franks A，et al. Bacterial endophytes：recent developments and applications[J]. FEMS Microbiology Letters，2008，278（1）：1-9.

[4]牛西午. 中国锦鸡儿属植物资源研究——分布及分种描述[J]. 西北植物学报，1999，19（5）：107-133.

[5]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[6]许曼琳，段永平，吴祖建，等. 芽孢杆菌两菌株对香蕉炭疽病菌的抑制作用及其机制[J]. 云南农业大学学报，2009，24（4）：522-527.

[7]李怡萍，梁革梅，仵均祥，等. 苏云金芽孢杆菌杀虫机理及害虫对其抗性机制的研究进展[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（9）：118-128.