桑粉虱不同寄主植物田间群主要酶活性比较

江秀均+柴建萍+谢道燕+等

摘要：采用酶活力测定法，比较桑粉虱6种寄主植物（桑树、黄瓜、烟草、菜豆、马铃薯、番茄）田间种群羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的变化。结果表明，6种植物粉虱种群乙酰胆碱酯酶活力马铃薯种群最高，烟草最低，且桑树种群与其他种群相比差异显著或极显著；羧酸酯酶的活性是番茄种群最高，菜豆种群最低，桑树粉虱种群与黄瓜和马铃薯种群相比差异不显著，与番茄种群相比差异显著或极显著，与烟草和菜豆种群相比差异显著；谷胱甘肽-S-转移酶活性是桑树种群最高，菜豆种群最低，桑树种群显著高于其他植物粉虱种群。

关键词：桑粉虱；寄主植物；羧酸酯酶；乙酰胆碱酯酶；谷胱甘肽-S-转移酶；酶活力

中图分类号： S888.72文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0132-03

收稿日期：2013-09-10

作者简介：江秀均（1981—），女，云南昭通人，助理研究员，主要从事桑树病虫害的研究。E-mail：jxjynbb@163.com。

通信作者：罗雁婕，博士，副研究员，主要从事桑树病虫害的研究。E-mail：yanjieluo@126.com。桑粉虱（Bemisia myricae Kuwana）隶属昆虫纲（Insecta）同翅目（Homoptera）粉虱亚目（Aleyromorpha）粉虱科，别称白虱、杨梅粉虱，是近年来我国桑园的主要害虫之一。近年来，云南蒙自地区大棚蔬菜得到快速发展，加上当地独特的暖冬气候，桑粉虱可以在桑树及其他农作物间交替转移，全年危害，猖獗成灾，给农业生产带来较大的损失。据相关报道，桑粉虱的寄主有200余种，包括桑树、黄瓜、菜豆、茄子、番茄、青椒、甘蓝、马铃薯等多种蔬菜以及花卉和部分果实[1-2]。由于桑粉虱个体小，发育周期短，繁殖力强，世代重叠，易产生抗性，因而化学防治难以控制桑粉虱的危害。

昆虫体内保护酶是当昆虫受到胁迫时，如不良环境、次生代谢物、抗性品种等产生的适应性酶系，被公认为与昆虫的抗药性有关[3-5]。羧酸酯酶（AchE）、谷胱甘肽转移酶（GSTS）是害虫体内重要的解毒酶系，在对外源化合物的解毒代谢和杀虫剂抗性机制中起重要作用[6]。乙酰胆碱酯酶是昆虫体内有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标酶，昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性与乙酰胆碱酯酶的敏感性下降有关[7]，同时寄主植物本身也会影响取食寄主植物昆虫体内酶系的变化。因为不同寄主植物中所含的植物次生物质种类不同，而有害植物次生代谢物质可诱导昆虫激活或抑制体内相关解毒酶系，以加强昆虫自身的保护作用，免受植物次生代谢物质的危害[8]。目前，针对桑粉虱抗药性研究较少，本研究以云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所的桑树及桑园周边间套作6种植物粉虱为研究对象，分析桑粉虱不同寄主植物田间种群的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-转移酶活性的差异，从生化水平上揭示桑粉虱抗性相关酶活性差异，确定桑粉虱在田间不同寄主植物上抗药性的差异，为桑粉虱的综合防治提供理论指导。

1材料与方法

1.1药剂与仪器

1.1.1药剂1-氯-2、4-二硝基苯（Sigma），坚固蓝B盐（Sigma-Aldrich），毒扁豆碱（Siyma），碘化硫代乙酰胆碱（Acros），5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（J&K 化学有限公司提供），牛血清蛋白、还原型型谷胱甘肽、1-萘乙酸等化学品购自云科生物工程公司。

1.1.2仪器BioMate 3双光束紫外/可见光核酸蛋白分析仪，Sorvall Primo R台式高速冷冻离心机和IMS-40（小型）雪花制冰机，恒温水浴锅。

1.2虫源

桑树（Morus alba L.） 品种云桑2号粉虱种群是2012年8月采自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所内的桑园，烟草粉虱种群2012年8月下旬采自草坝镇13村桑园附近的烟草；番茄（Solanum lycopersicum）种群是2012年8月采自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所试验大棚周边；马铃薯（Solanum tuberosum）种群8月采自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所试验大棚周边的马铃薯地；黄瓜（Cucumis sativus Linn）和菜豆种群是6-8月采自桑园周边种植的黄瓜苗和菜豆苗上。所采集的作物都是在桑园周边20～500 m范围内，采样期间番茄和烟草地块用药的频率和剂量较高，采样时是蚕期，桑园内用药较少，黄瓜、马铃薯和菜豆也没用药，距离桑园较近约20 m。

1.3桑粉虱不同寄主植物酶活性的测定

1.3.1活性测定酶活力的测定参照Gorun改进的Ellman方法[9]。取粉虱成虫150头，加入1.5 mL0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH值为7.5），冰浴匀浆，在 4 ℃、10 000 r/min下离心10 min，取上清液作酶液。反应体系中依次加入 0.1 mol/L PBS、10 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱，工作酶液 100 μL，于27 ℃恒温水浴5 min，加 0.125 mmol/L DTNB显色剂，于412 nm处测D值，每个处理重复3次。根据D值和蛋白质含量计算比活力。

1.3.2羧酸酯酶的酶活性测定酶活性测定参照何林等的方法[10-11]。先以α-萘酚量为自变量、D值为因变量作标准曲线。取粉虱150头，加pH值为7.0的0.04 mol/L磷酸缓冲液1.5 mL，于冰水浴中匀浆，匀浆液于10 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上清液稀释20倍作为工作酶液。以 0.3 mmol/L α-萘酚含0.1 mmol/L毒扁碱）为底物加工作酶液1 mL混匀30 ℃恒温水浴30 min，加显色剂1 mL，静置 15 min 后于 600 nm 处测D值。根据α-萘酚标准曲线和酶源蛋白质含量，将D值换算成比活力[mmol/（mg·min）]。

1.3.3还原型谷胱甘肽的酶活性测定酶液活性的测定参照何林等的方法[10-11]。取粉虱150头，加入66 mmol/L pH值7.0的磷酸缓冲液（含2 mmol/L EDTA），冰浴匀浆，匀浆液与10 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液稀释10倍作为工作酶液。用0.03 mol/L CDNB作底物，经GSTs作用，与还原型谷胱甘肽（1.0 mmol/L）反应生成硫醇尿酸衍生物，在 340 nm 处测D值。根据酶液蛋白质含量测定结果，将D值换算成比活力[mmol/（mg·min）]。

1.4蛋白质含量的测定

参照Bradford的方法考马斯亮蓝G-250染色法测定[12]。

1.5数据统计与分析

所有数据的统计和分析都是在Excel和SPSS 17.0上进行的。

2结果与分析

2.1乙酰胆碱酯酶比活力测定

桑粉虱6种寄主植物乙酰胆碱酯酶的比活力以马铃薯种群最高，其次是菜豆、桑树、番茄、黄瓜，烟草种群最低。桑树种群乙酰胆碱酯酶同其他寄主植物粉虱种群相比差异极显著；其他寄主植物粉虱种群间除了马铃薯与菜豆、黄瓜与烟草间差异不显著外，其余植物种群之间均差异极显著。

桑粉虱不同寄主植物AchE的比活力比较

寄主植物乙酰胆碱酯酶比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差异显著性5%1%马铃薯2.844 0±0.446 11.704aA菜豆2.621 2±0.164 21.570aA桑树1.669 3±0.140 51.000bB番茄1.098 3±0.140 50.658cC黄瓜0.343 5±0.017 00.206dD烟草0.236 9±0.002 90.142dD注：*表示以寄主植物桑树的值为1进行比较。

2.2羧酸酯酶比活力测定

桑粉虱不同寄主植种群羧酸酯酶比活力由高到低为番茄>烟草>黄瓜>桑树>马铃薯>菜豆，番茄种群极显著高于其他粉虱种群。桑树粉虱种群与黄瓜和马铃薯种群相比差异不显著，与番茄相比差异极显著，与烟草和菜豆种群相比差异显著。其他寄主植物种群间除烟草和黄瓜、马铃薯和菜豆差异不显著外，其余种群间差异显著。

2.3谷胱甘肽-S-转移酶比活力测定

不同寄主植物粉虱种群谷胱甘肽-S-转移酶的比活力以桑树种群最高，其次是番茄、黄瓜、马铃薯、烟草，菜豆种群最低，桑树种群是菜豆种群的2.2倍。桑树种群除了与番茄种群间差异显著外，与其他植物粉虱种群相比差异显著或极显著。其余植物种群间除了黄瓜和表2桑粉虱不同寄主植物CarE和GSTs的比活力

寄主植物羧酸酯酶谷胱甘肽S-转移酶比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差异显著性5%1%比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差异显著性5%1%番茄0.2826±0.08422.907aA2.8845±0.10390.920bA烟草0.163 7±0.020 61.684bB1.872 2±0.045 90.597dC黄瓜0.104 2±0.007 41.072bcBC2.542 2±0.047 20.811cB桑树0.097 2±0.004 91.000cBCD3.136 4±0.058 11.000aA马铃薯0.061 4±0.003 30.632cdCD2.453 5±0.275 80.782cB菜豆0.012 7±0.000 40.131dD1.418 6±0.128 90.452eD注：*表示以寄主植物桑树的值为1进行比较。

马铃薯间种群间差异不显著外，其他粉虱种群间差异显著或极显著。

3结论与讨论

昆虫对杀虫剂产生抗性的重要机制是靶标酶敏感性降低和解毒酶活性增高。乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂杀螨剂的靶标，羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶是昆虫体内主要的解毒酶系。据报道，植物次生物质可诱导、激活或抑制害虫体内与杀虫剂抗性相关解毒酶系和靶标酶系，导致害虫对药剂的代谢酶活性或敏感性发生明显改变[13]。王红等报道，取食不同寄主植物的烟粉虱体内乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-还原酶活力均差异显著[4，13-15]，表明寄主植物对烟粉虱解毒酶和保护酶活性均有诱导性；傅建炜等报道，取食不同寄主植物对黄曲条跳甲成虫羧酸酯酶活性存在较大的影响[16]；高希武报道，由于寄主植物不同，棉蚜体内羧酸酯酶活性也不同[17]；谢佳燕等报道，不同寄主植物会对取食的棉蚜乙酰胆碱酯酶活性产生影响[18]。本研究结果表明，不同寄主植物上桑粉虱乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性差异显著，这可能是因为不同寄主植物田间用药的水平及施药种类，以及不同寄主植物体内所含的植物次生代谢物的种类和植物组织营养状态的影响，导致桑粉虱不同寄主植物种群解毒酶和靶标酶活性有明显差异。

本研究分别比较了不同寄主植物上桑粉虱田间种群的CarE、GSTs和AchE的活性，发现桑粉虱体内的2种解毒酶和1种靶标酶在不同寄主植物种群上表现出不同的变化趋势。桑粉虱6种寄主种群中，马铃薯种群AchE活性最高，烟草种群最低；番茄种群CarE活性极显著高于其他寄主种群；桑树种群GSTs活性最高，菜豆种群最低，桑树种群显著高于其他种群。可能是由于不同植物在害虫防治时施药频率和种类的不同，造成桑粉虱酶活性的差异；同时，桑粉虱取食不同的寄主植物，受植物的次生代谢物质的影响，也会导致体内解毒酶活性的变化；也可能受植物组织营养状况的影响，使桑粉虱不同寄主种群解毒酶活性有明显差异，以适应不同的寄主植物。具体是什么引起酶活性的差异，还有待进一步研究阐明。本研究结果可为桑粉虱综合防控提供理论指导。

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