白芍总苷辅助治疗SLE对患者外周血CD4+CD25+T细胞表达的影响*

2014-08-11钟益萍米向斌张堂德孙乐栋

重庆医学 2014年32期

关键词：总苷红斑狼疮白芍

钟益萍，米向斌，张堂德，孙乐栋

(南方医科大学珠江医院皮肤科,广州 510282)

白芍总苷辅助治疗SLE对患者外周血CD4+CD25+T细胞表达的影响*

钟益萍，米向斌，张堂德，孙乐栋△

(南方医科大学珠江医院皮肤科,广州 510282)

目的探讨白芍总苷(TGP)辅助治疗系统性红斑狼疮(SLE)对患者外周血CD4+CD25+T细胞表达水平的影响。方法采用流式细胞术检测健康对照组、常规组、TGP组外周血CD4+CD25+T细胞比率。结果 SLE患者CD4+CD25+T细胞表达率为(6.15±1.21)%，健康对照组CD4+CD25+T细胞表达率为(12.30±1.78)%。活动期SLE患者与健康对照组CD4+CD25+T细胞表达率比较，差异有统计学意义(t=22.03，P<0.05 )；常规组治疗前后外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平差异有统计学意义(t=-12.30，P<0.05)；TGP组治疗前后外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平差异也有统计学意义(t=-16.68，P<0.05)。常规组外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平为(9.34±1.37)%，TGP组外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平为(11.49±1.14)%，两组差异有统计学意义(t=-6.46,P<0.05 )。结论活动期SLE患者CD4+CD25+T细胞表达率水平显著低于健康对照组；SLE患者经过TGP辅助治疗后CD4+CD25+T细胞表达率显著提高。TGP治疗可能作用于CD4+CD25+T细胞。

红斑狼疮，系统性；流式细胞术；CD4+CD25+T细胞；白芍总苷

Abstract:Objective to investigate the effect of TGP assisted treatment of SLE on the expression of CD4+CD25+T in patient peripheral blood.Methods flow cytometry was used to detect the peripheral blood CD4+CD25+T cells in healthy group,routine group and TGP group.Results The expression rate of CD4+CD25+T cells in SLE patients was (6.15±1.21)%,and that of the healthy controls was (12.30±1.78)%.The expression rate of CD4+CD25+T cells in active SLE patients and healthy controls were significantly different (t=22.03,P<0.05).In the routine group,the expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells before and after treatment were significantly different (t=12.30,P<0.05);in the TGP group,the expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells before and after treatment were significantly different,too (t=16.68,P<0.05).The expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells in routine group and TGP group were (9.34±1.37)% and (11.49±1.14)% respectively,and the difference was statistically significant (t=6.46,P<0.05).Conclusion The expression rate of CD4+CD25+T cells in active SLE patients was significantly lower than that of healthy controls;the expression rate of CD4+CD25+T cells in SLE patients increased significantly after treatment.The TGP treatment may work on CD4+CD25+T cells.

目前，CD4+CD25+T细胞在系统性红斑狼疮(SLE)中的发病机制越来越受关注，且发现CD4+CD25+T细胞在疾病发展中数量降低及功能下降[1-2]。有研究表明，CD4+CD25+T细胞在机体中能控制自身免疫反应和维持免疫耐受；且CD4+CD25+T细胞控制机体损伤后的免疫反应，即如果机体内CD4+CD25+T细胞缺失可能将导致SLE发生[3]。临床治疗SLE中，在使用糖皮质激素和免疫抑制剂的基础上加用白芍总苷(TGP)可显著减少激素的用量及降低不良反应[4-9]。然而,TGP治疗SLE的详细机制目前仍不清。因此，对TGP辅助治疗SLE的研究有重要意义。

目前，关于CD4+CD25+T细胞在SLE患者中的研究较多，但关于TGP对SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞比率变化的影响研究则报道相对较少。因此，本研究探讨TGP治疗SLE时对CD4+CD25+T细胞的调控作用，探讨TGP治疗SLE的免疫学机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年3月至2013年9月本院皮肤科就诊的活动期SLE患者60例，其中男4例，女56例，年龄18～49岁，平均32岁。分为常规组(30例)，TGP组(30例)。诊断标准严格按照美国风湿病学院1997年修订的SLE分类标准执行。按SLE病情活动程度的评价根据美国SLE疾病活动指数评分(SLEDAI)选取活动期患者(≥6分)。同时选取60例本院健康体检者为对照组。全部患者均无哮喘、荨麻疹、湿疹、糖尿病、炎症性肠病和其他风湿病[10]。2组间性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器与试剂藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD25+单克隆抗体 (IgG2a/PE)、异硫氰荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD4+单克隆抗体(IgG2b/FITC)、同型对照鼠 IgG2b/FITC、鼠IgG2a/PE(深圳晶美有限公司)；FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司仪器)[11]。

1.3 方法

1.3.1 病例采集晨起空腹抗凝管管抽取静脉血2 mL,离心取血清标本，抗凝血100 μL，室温放置30 min后立即送检。

1.3.2 治疗方法两组患者均用泼尼松联合环磷酰胺治疗,剂量和方法参考2010版中华医学会风湿病分会系统性红斑狼疮诊断及治疗指南。泼尼松的用量为0.5～1.0 mg·kg-1·d-1,治疗6周后,周用量每周减少5 mg,至30 mg/d。如治疗过程中出现病情复发或加重情况,恢复糖皮质激素使用剂量至0.5～1.0 mg/kg。环磷酰胺(CYC)冲击疗法：CYC 0.50～0.75 g/m2体表面积+生理盐水100 mL,1 h 内快速静脉滴注。如治疗过程中出现复发或病情加重等情况,则缩短CYC冲击时间。TGP组患者在此基础上加用TGP治疗(剂量为0.6 g，2次/d)，疗程60 d。所有患者于第1、60天抽取晨起空腹外周静脉血。

1.3.3 临床观察指标患者临床表现(发热、新发皮疹、口腔溃疡、关节炎、脱发、中枢神经系统损害)、实验室检查(血常规、尿常规、大便常规，补体、抗双链DNA抗体、抗核抗体、抗Sm抗体、心脏彩超、腹部彩超、肺部CT)[10]。

1.3.4 CD4+CD25+T细胞百分率的检测标本分两管流式管：检测管和同型对照管。取乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝的SLE患者外周血100 μL，分别放入各流式管内。检测管加入IgG2b及 IgG2a，同型对照管加人鼠IgG2b/FITC及鼠 IgG2a/PE各10 μL，轻轻混匀。室温避光20 min后，加人红细胞裂解液 2 mL，振荡混匀后避光至 10 min。1 000 r/min离心 5 min，弃上清液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，再用PBS冲洗1次，离心弃上清液，加入0.3 mL PBS悬浮细胞，室温避光10 min后上机使用光源 488 nm 的氩激光，上机前先用标准微球进行光路和流路的校正，使变异系数(CV)在 2%以下。用同型对照确定荧光阴性范围，根据细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特性初步圈取淋巴细胞群门，每份标本中测定淋巴细胞群门中10 000个淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞的百分率,实验步骤参照文献[11]。

2 结果

2.1 SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平 SLE患者治疗前和健康对照组外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平为(6.15±1.21)%和(12.30±1.78)%。其中SLE患者治疗前外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平低于健康对照组，差异有统计学意义(t=22.03,P<0.05)，见图1。

*:P<0.05，与健康组比较。

图1 外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平的比较

2.2 SLE患者经2种方案治疗后外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平常规组治疗前后CD4+CD25+T细胞表达率分为(6.15±0.94)%、(9.38±1.37)%，二者差异有统计学意义(t=-12.30，P<0.05)；TGP组治疗前后CD4+CD25+T细胞表达率分为(6.15±1.45)%、(11.49±1.14)%，二者差异也有统计学意义(t=-16.68，P<0.05)；常规组与TGP组治疗后CD4+CD25+T细胞表达率比较，差异有统计学意义(t=-6.46,P<0.05 )，见图2。

*:t=-6.46,P<0.05，与TGP组治疗后比较。

图2 外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平比较

3 讨论

SLE作为一个重要的系统性自身免疫疾病，主要表现为自身反应性T细胞和B细胞的活化，以及致病性自身抗体的产生。大量研究显示，自身免疫性疾病的易感和诱发与CD4+CD25+T细胞的数量降低或功能减退存在着重要相关性[12-13]。其中也包括SLE的具体发生原因。CD4+CD25+T在机体免疫体系中所发挥的作用主要体现在自身免疫耐受，同时对外来抗原保持一定的应答活性[14]。其功能主要为:通过释放抑制性细胞因子，抑制T细胞对自身抗原的免疫应答，进而抑制其细胞的活化对自身组织的损害。除了对效应T细胞的影响外，CD4+CD25+T细胞还可抑制炎症细胞及其产生的相关炎症因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6)和调节因子(IL-10)以减轻机体组织损伤[13]。这一过程对维持内环境稳态具有重要意义，主要体现在预防自身免疫性疾病的发生及诱导移植耐受等[15-17]。

本研究中，对各60例活动期SLE患者及健康人抽取外周血，测定CD4+CD25+T细胞比率水平，结果显示活动期SLE患者外周血中CD4+CD25+T细胞表达率明显低于健康人。通过对治疗后稳定的SLE患者进行检查发现，外周血CD4+CD25+T细胞的表达率升高但仍低于健康对照组。结论进一步证实SLE患者的发病过程与CD4+CD25+T细胞水平之间存在的相关性[10-11，18]。即 CD4+CD25+T细胞水平的下降会导致T、B淋巴细胞激活，产生多种自身抗体，最终造成多器官损伤[19]。

临床上对SLE的治疗，常规以糖皮质激素和环磷酰胺为主。在改善患者病情的同时伴随着一定的药物不良反应的发生，如糖皮质激素长期、大量使用易引起感染、消化道溃疡、骨坏死等严重并发症；此外，环磷酰胺长期使用，则会引起肝毒性等不良反应[20]。因此，在保证SLE患者药物治疗有效性的同时如何最大程度地降低不良反应是临床医师所面临的重要问题。针对这一问题，国内部分学者通过使用TGP进行联合辅助治疗，临床发现激素及免疫抑制剂的使用剂量降低且不良反应得到改善[21-22]。

本试验在常规用药治疗的基础上结合使用TGP进行辅助治疗，比较常规组与TGP组间的CD4+CD25+T细胞水平。结果发现,TGP辅助治疗60 d后,其CD4+CD25+T细胞数量较治疗前显著上升,并且要高于常规组水平。这一变化趋势同疾病的具体临床表现变化一致。表明TGP对SLE的治疗作用机制之一是上调CD4+CD25+T细胞数量,从而抑制各种免疫反应。但其具体机制尚不甚清楚，有待进一步研究。

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The effect of TGP assisted treatment of SLE on the expression of CD4+CD25+T in patient peripheral blood*

ZhongYiping,MiXiangbin,ZhangTangde,SunLedong△

(DepartmentofDermatology,theAffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China)

lupus erythematosus,systemic;flow cytometry;CD4+CD25+T cells;TGP