大蒜素对贝赫切特病的治疗作用及机制探讨*

钟建桥 ，先德海 ，廖勇梅

(1.泸州医学院附属医院皮肤科,四川泸州 646000，2.泸州医学院解剖教研室，四川泸州 646000)

·论 著·

大蒜素对贝赫切特病的治疗作用及机制探讨*

钟建桥1，先德海2，廖勇梅1

(1.泸州医学院附属医院皮肤科,四川泸州 646000，2.泸州医学院解剖教研室，四川泸州 646000)

目的 探讨大蒜素对实验性贝赫切特病(BD)的治疗作用及机制。方法 构建BD模型鼠，将其分为实验组、阳性对照组和阴性对照组，分别鼻饲注入大蒜素、秋水仙碱和生理盐水。肉眼观察治疗前后皮损的变化，ELISA法检测治疗前后血清γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4和化学比色法检测总抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷甘肽过氧化物酶(GSH-PX)。结果 模型小鼠背、腹、阴部出现溃疡，IFN-γ、TNF-α、IL-4和MDA升高，T-AOC、SOD和GSH-PX下降。治疗20 d后实验组和阳性对照组小鼠溃疡基本愈合；30 d后实验组仅2只复发，阳性对照组有6只复发，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后实验组IFN-γ、TNF-α和IL-4较治疗前降低(P<0.01)，与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验组T-AOC、SOD和GSH-PX较治疗前升高，MDA下降 (P<0.01)，与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 大蒜素是治疗实验性BD的有效药物，可能是通过抑制炎症因子、阻止氧化应激而作用。

贝赫切特综合征；大蒜素；免疫反应；氧化应激

贝赫切特病(Behcet′s disease,BD)是一种慢性炎症性多系统性血管炎，可累及皮肤黏膜、眼部等多个系统，迄今为止无满意疗法。尽管BD的确切机制不清，但大多认为与遗传、感染、免疫及氧化应激等有关，而免疫紊乱和氧化应激在其发病中起了重要作用[1-2]。大蒜素来源于大蒜，具有调节免疫、抗氧化、抗感染等作用，为BD的治疗带来新希望[3]。尽管大蒜素已被广泛应用于多种疾病，但在BD中的治疗研究目前尚未见报道。本研究通过构建BD动物模型来观察大蒜素的治疗效果，同时检测血清中免疫炎症因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4和氧化应激相关指标总抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷甘肽过氧化物酶(GSH-PX)以探讨大蒜素的治疗机制，为BD临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物为4～5周大小的健康雄性ICR小鼠，共40只，平均体质量约25 g，由泸州医学院实验动物中心提供；Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)购自武汉病毒研究所；大蒜素(江苏正大清江制药有限公司)；秋水仙碱片(云南植物药业有限公司)。UV-1800pc紫外分光光度计(Mapada)、MODER-680酶标测试仪(Bio-Rad，美国)、低温冰箱、超净工作台和电热恒温鼓风干燥箱等。IFN-γ、TNF-α、IL-4、T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX试剂盒均购自美国Millipore试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 构建BD动物模型 选取40只健康雄性ICR小鼠，分为两组：模型组30只、健康对照组10只。参照文献[4]用针刺破小鼠耳垂，然后注入Ⅰ型HSV 1.0×106 U/mL，10 d 1次，共2次，16周后模型组小鼠均造模成功。健康对照组不作任何处理。造模期间密切观察皮损的变化，并进行摄像。小鼠在室温20～22 ℃、12 h循环光照(每天早晨8:00开始)条件下进行喂养。

1.2.2 药物配制、实验分组与治疗 (1)药物配制：将20 mg/片的大蒜素以生理盐水稀释配制成浓度为25 μg/mL；秋水仙碱片(1 mg/片)以生理盐水稀释浓度为2 μg/mL。(2)分组：将造模成功的BD模型小鼠分为实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组各10只，分别注入大蒜素、秋水仙碱和生理盐水。(3)治疗方法：实验组每只以1 mL/d的剂量(即25 μg)经鼻饲管注入大蒜素溶液，每天1次，连续20 d；应用相同方法对阳性对照组每只注入秋水仙碱1 mL/d(即2 μg)，阴性对照组每只注入相同量(1 mL/d)的生理盐水。

1.2.3 指标检测 肉眼观察治疗前后鼠皮损变化：分别观察治疗前、治疗结束后以及继续喂养10 d后鼠、皮损的变化及复发情况。细胞因子和氧化应激指标：治疗前和治疗20 d后分别抽取小鼠晨起空腹静脉血。采用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的水平，酶标测试仪450 nm处读数。化学比色法检测T-AOC和MDA、SOD、GSH-PX水平，分光光度计420～630 nm读数。均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 BD动物模型鉴定 经典模型诊断标准包括主要症状和次要症状。主要症状为口腔、生殖器、皮肤的溃疡和眼部损害。次要症状有关节炎、胃十二指肠溃疡和神经系统损害。病理组织变化为真皮层大量以淋巴细胞为主的炎症细胞聚集在血管周围。BD样小鼠至少要出现一种主要症状和一种次要症状或病理组织变化。如达到上述标准可认为BD动物造模成功。

2 结 果

2.1 肉眼观察动物模型的BD样症状和组织病理表现 模型组在注射HSV-1 16周后30只小鼠背部、腹部和外阴处出现大小不一深在溃疡，伴少许渗液或结痂，同时出现不同程度的四肢活动受限(关节炎)。在真皮层可见大量炎症细胞(以淋巴细胞为主)围绕血管周围聚集。而健康对照组皮肤和外阴黏膜未见任何皮损，小鼠活动良好，组织病理表现正常。根据BD经典模型诊断标准，本实验已成功构建BD动物模型30只，见图1、2。

2.2 大蒜素等治疗20 d后鼠皮损肉眼变化和30 d后复发情况 治疗20 d后，实验组和阳性对照组溃疡完全愈合，可见粉红色新鲜瘢痕及皮肤生长。阴性对照组而部分溃疡增大、增深，伴脓性分泌物。治疗30 d后实验组2只小鼠背部可见一浅小溃疡；阳性对照组6只小鼠背腹部可见散在深浅不一溃疡；阴性对照组部分溃疡缩小，部分出现新溃疡。治疗30 d后实验组复发率为20%(2/10)，阳性对照组为60%(6/10)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 大蒜素等治疗前后鼠血清中IFN-γ、TNF-α和IL-4水平变化 造模后模型组IFN-γ、TNF-α和IL-4表达水平较健康对照组明显升高(P<0.01)，见表1。治疗后实验组和阳性对照组IFN-γ、TNF-α和IL-4表达水平均下降，较治疗前差异有统计学意义(P<0.01)，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后阴性对照组IFN-γ、TNF-α、IL-4表达水平略有下降，但与治疗前比较差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后实验组和阳性对照组分别与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图1 造模16周后模型鼠肉眼表现

图2 造模16周后模型鼠组织病理表现(×200)表1 模型组与健康对照组血清细胞 因子水平比较

组别nIFN⁃γTNF⁃αIL⁃4模型组3037．51±18．03123．83±48．88116．15±37．99健康对照组304．63±1．8915．07±5．2313．21±5．05t5．71∗6．96∗8．47∗

*：P<0.01，与健康对照组比较。

2.4 各组治疗前后鼠血清中T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表达水平变化 造模后模型组T-AOC、SOD和GSH-PX表达水平较健康对照组降低(P<0.05)，而MDA较健康正常对照组升高(P<0.05)，见表2。治疗后实验组T-AOC、SOD和GSH-PX表达水平升高，MDA下降，与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01)；而阳性对照组治疗前后比较仅SOD和GSH-PX升高明显(P<0.05)，其余指标及阴性对照组与治疗前比较无明显变化(P>0.05)；治疗后实验组T-AOC、SOD和GSH-PX表达水平较阳性对照组和阴性对照组升高，MDA降低(P<0.05)，尤以T-AOC、MDA差异有统计学意义(P<0.01)；治疗后阳性对照组与阴性对照组两组间比较，其氧化相关指标表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

*：P<0.01，与治疗前相应细胞因子比较；#：P<0.01，与阴性对照组同时间点相应细胞因子比较。

图3 治疗前后同组、治疗后各组间IFN-γ、TNF-α 和IL-4表达水平比较表2 模型组与健康对照组血清氧化物水平比较±s)

*：P<0.05，**：P<0.01，与健康对照组比较。

*：P<0.01，#:P<0.05,与治疗前相应指标比较；!：P<0.01，&：P<0.05,与阳性对照组同时间点相应指标比较；$：P<0.01，与阴性对照组各指标比较。

图4 治疗前后同组、治疗后各组间T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表达水平比较

3 讨 论

BD是一种以血管炎为基本病变的免疫性疾病，可累及全身多系统器官，若治疗不及时可发生致命性的脏器损害。尽管一些传统药物对BD有一定疗效，但难以治愈，停药后易复发，长期使用可能会导致严重不良反应[5]。而近年来采用的TNF-α抑制剂等生物制剂虽然治疗BD有效，但因其潜在不良反应或昂贵的费用而应用受限[6]。大蒜素为大蒜的一种活性成分，来源丰富，价额低廉无不良反应，具有抗氧化、调节免疫等多种药理作用，尤其在防治心血管损伤的相关研究较多[3,7]。故在大蒜素广泛用于治疗心血管疾病等安全有效的启示下，笔者推测大蒜素亦可治疗嫡属血管炎性疾病的BD，基于这一理论基础本研究对大蒜素在BD中的治疗作用及机制进行了探讨[8]。

为观察大蒜素对BD的疗效，笔者成功构建了BD动物模型，然后予以大蒜素等治疗，结果发现大蒜素和秋水仙碱均能有效促进小鼠溃疡愈合和新鲜皮肤生长。尤其在治疗30 d后，且实验组复发率仅为20%，而阳性对照组较实验组却有3倍的复发率，差异十分明显。初步说明大蒜素具有促进BD溃疡愈合，减少复发的作用。

为进一步探讨大蒜素对BD的治疗作用机制，本实验又对涉及BD发生、发展的重要免疫炎症介质和氧化应激指标进行了研究。通过检测治疗前后相关指标的表达水平发现：造模后小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-4及MDA水平明显升高，而T-AOC、SOD和GSH-PX显著下降，符合BD的发病过程[9-10]。经大蒜素等治疗后，大蒜素和秋水仙碱能明显降低IFN-γ、TNF-α和IL-4表达，减轻炎症介质的释放。同时大蒜素能显著增强T-AOC、SOD和GSH-PX表达，减少MDA产生，较秋水仙碱能更好地上调SOD、GSH-PX活性、增强抗氧化能力、减少氧化物形成。这可能与大蒜素本身具有抗感染、抗氧化和免疫调节作用，而秋水仙碱仅有免疫抑制而无抗氧化作用等有关；同时由于大蒜素具有抗氧化作用，可阻止氧化应激损伤，秋水仙碱无此作用则使氧化应激状态持续存在，导致损害进一步加重或反复发作，这也解释了为什么大蒜素与秋水仙碱疗效相当，但复发率较低的原因。本实验再次证实大蒜素具有抗氧化应激损伤、减少ROS产生、抑制炎症介质释放的作用，这与国内外较多报道结果相一致[11-12]。此外，在实验中发现秋水仙碱可使SOD和GSH-PX表达有所升高，但与生理盐水比较差异无统计学意义(P>0.05)，可能与秋水仙碱抑制免疫炎症介质释放导致SOD和GSH-PX破坏暂时减少，使之一过性升高有关。

综上所述，本研究发现大蒜素对实验性BD具有治疗作用，且复发率低于秋水仙碱。其作用机制可能是通过抑制BD发病中的一些重要炎症介质的分泌和释放，同时增强抗氧化力、减少氧化物形成，最终阻止BD组织细胞损伤。本实验为初步探索，有待进一步临床实验和大样本病例对照实验以证实。

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To investigate the treatment and mechanism of allicin on Behcet′s disease*

ZhongJianqiao1,XianDehai2,LiaoYongmei1

(1.DepartmentofDermatology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofHumanAnatomy,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:Objective To explore the therapeutic effect and the mechanism of allicin on experimental Behcet′s disease (BD).Methods BD models were established.Then,model mice were randomly divided into experimental group,positive control group and negative control group,with respectively nasogastric infusion allicin,colchicine and saline respectively.Before and after treatment,the changes of the skin lesions were visually observed.Cytokines of IFN-γ,TNF-α and IL-4 in serum were detected by ELISA analysis,while the markers of T-AOC,MDA,SOD and GSH-PX by chemical colorimetric methods.Results After modeling,ulcers appeared on the back,abdomen and genital of model mice with IFN-γ,TNF-α,IL-4 and MDA elevation,while T-AOC,SOD and GSH-PX decrease.Twenty days of treatment later,ulcer on mice in the experimental group and positive control group healed.After 30 days,only two mice in the experimental group recurred,while 6 mice in the positive control group,which showed a significant difference between two groups (P<0.05).After treatment,IFN-γ,TNF-α and IL-4 levels in the experimental group were markedly lower than pretreatment (P<0.01),but no significant difference compared with the positive control group (P>0.05).Meanwhile,T-AOC,SOD and GSH-PX levels in the experimental group were significantly higher than those in the pretreatment,but MDA was lower (P<0.01).In comparison with the positive control group,levels of those markers in the experimental group changed remarkably (P<0.05).Conclusion Allicin is an effective drug in the treatment of experimental BD.The therapeutic mechanism of allicin may be the inhibition of inflammatory mediators and prevention of oxidative stress.

Behcet syndrome;allicin;immune response;oxidative stress

四川省卫生厅项目资助(100283)。 作者简介：钟建桥(1973-)，副主任医师，博士，主要从事皮肤美容与炎症性疾病的研究工作。

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.32.001

R758.69

A

1671-8348(2014)32-4273-03

2014-01-20

2014-04-22)