GJIC渐弱剂18α-甘草次酸对兔脂肪细胞向成骨细胞横向分化的影响

王吉博，曾 旋，彭 浩，王凤宇，王兆杰

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041)

GJIC渐弱剂18α-甘草次酸对兔脂肪细胞向成骨细胞横向分化的影响

王吉博，曾 旋，彭 浩，王凤宇，王兆杰

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041)

目的 探讨缝隙连接通讯渐弱剂18α-甘草次酸(GA)对脂肪细胞向成骨细胞横向分化及细胞间缝隙连接通讯的影响。方法 选取3月龄新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织，分离提取成熟脂肪细胞，使其去分化得到去分化脂肪细胞，取第三代去分化的脂肪细胞进行成骨诱导，加入GJIC渐弱剂18α-GA设为减弱组，并设立对照组，MTT法观察18α-GA对细胞倍增是否有影响，进行茜素红钙结节染色和I型胶原免疫组化染色对成骨细胞定性检测，Western blot技术和划痕标记染料示踪法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达。结果 MTT法检测结果显示18α-GA对细胞生长增殖无显著影响。茜素红染色显示均发现紫红色结节。免疫组化染色显示减弱组I型胶原表达减弱，SLDT 法显示减弱组荧光染料扩散低于对照组，Western blot技术检测结果显示减弱组Cx43蛋白的表达下降。结论 18α-GA可以减弱缝隙连接通讯以降低脂肪细胞向成骨细胞分化的能力。

脂肪细胞；成骨细胞；去分化；缝隙连接通讯；18α-甘草次酸

骨质疏松症作为临床上的常见病、多发病，主要以成骨细胞数量的减少为特征，同时发现骨组织中脂肪细胞数量增多，此现象的发生机制尚不明确。国内外研究多从骨髓间干细胞定向分化和调控角度考虑，较少从两种细胞的横向分化和细胞间信号传导调控角度考虑。但成骨细胞和脂肪细胞间的横向分化已经得到证实[1]。因此，本研究探讨了是否能够通过调控细胞间缝隙连接通讯(GJIC)来干预脂肪细胞向成骨细胞的横向分化，旨在为骨量减少性疾病提供一种新的理论依据，以期达到治疗骨量减少性疾病的目的。

1 实验资料

1.1 材料 体质量2.3～2.5 kg新西兰大白兔，DMEM/F12培养液(武汉博士德生物工程有限公司)等。

1.2 主要实验试剂配制

1.2.1 成骨诱导液配制 在新配制的基础培养基(含10%FBS)中依次加入100 mmol/L的地塞米松、0.05 mmol/L的维生素C、10 mmol/L的β-甘油磷酸钠，0.22 μm微孔滤器过滤除菌后4 ℃冰箱保存。

1.2.2 GJIC减弱剂的配置 将250 mg 18α-甘草次酸(GA)溶于45 mL无水乙醇中，充分搅拌，加入200 mL成骨诱导液中，0.22 μm微孔滤器过滤除菌后4 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 提取成熟的脂肪细胞 将3月龄健康新西兰大白兔空气栓塞法处死，置于无菌台上。取无菌培养皿1个，加入适量PBS液。在双腹股沟处取皮下脂肪组织约2 g，置于此无菌培养皿中。在无菌条件下，去除表面的结缔组织，并剪成糊状，移入15 mL离心管中，在离心管中滴入0.1% I型胶原酶3 mL，盖好瓶盖，置于37 ℃水浴箱中进行消化，30 min，每3 min震荡1次，加入含1%FBS体积分数的DMEM培养液6 mL终止消化，180 r/min离心10 min。收集上层液体，接种于25 cm2培养瓶，采用天花板贴壁法培养成熟的脂肪细胞。

1.3.2 成熟脂肪细胞去分化 10 d后继续在低氧低营养环境下培养，使其脱去脂滴，得到去分化脂肪细胞(DA)，其后采用正常培养(10%FBS的DMEM培养液)，每2 d更换1次培养液。待完全脱去脂滴呈长梭形、融合达80%时，进行传代。

1.3.3 分组并向成骨细胞诱导 选取第3代的去分化脂肪细胞，随机分为减弱组和对照组，减弱组中加入含18α-GA的成骨诱导液，对照组加入成骨诱导液。培养过程中光镜下观察细胞形态变化。

1.3.4 MTT法检测细胞毒性作用 分组后的细胞按1×103个/孔接种于96孔板内，向成骨细胞诱导后的第2天起，2组各取6个孔，检测各孔在490 nm下的吸光度(A)值，每天各取6孔进行检测，共检测7 d，并绘制2组细胞的生长曲线。

1.3.5 茜素红染色 取诱导后14 d的细胞，用无水乙醇进行固定，30 min后弃固定液，冲洗3遍后加入0.1%的茜素红Tris-HCL(pH 8.3)染色液染色30 min。

1.3.6 Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色 诱导2周后进行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色，吸去诱导液，用PBS冲洗3遍，每次冲洗2 min，加入4%的多聚甲醛固定30 min，根据免疫组化试剂盒要求染色。

1.3.7 划痕标记染料示踪(SLDT) 将2组细胞诱导2周后接种于35 mm直径培养皿中进行培养，显微镜下观察细胞汇合成均匀单层细胞后，PBS冲洗3遍，加入荧光黄(LY)溶液，用手术刀刀刃在培养皿中央做一直线划痕,5 min后用4%多聚甲醛固定3 min。用荧光倒置显微镜拍摄LY扩散情况，LY扩散距离使用计算机图像进行测量。

1.3.8 Western blot技术检测Cx43蛋白的表达 取诱导后的2组细胞，各取3 mL 4 ℃预冷的PBS液加入2个培养瓶中，将培养瓶平放入摇箱中摇动1 min，以充分洗涤细胞，弃去洗液。以同样的方法洗涤细胞2次，然后将培养瓶置于冰上。按Western blot试剂盒步骤进行操作，并进行曝光得到X线胶片。所得X线胶片用Chemi Imager 5500 V2.0软件扫描，通过Fluor Chert2.0软件进行定量分析，测得整合光密度值。

2 结 果

2.1 成熟脂肪细胞的去分化 成熟脂肪细胞于24 h开始贴壁生长，形状呈圆形空泡状，见图1；从48 h开始，圆形空泡状的脂肪细胞的胞质开始向周围伸展，第4天部分细胞胞质中的单个脂滴分裂成多个脂滴并向中央聚集，细胞形态逐渐由圆形变为椭圆形，见图2；在此环境下的第10天开始细胞逐渐伸展，形成不规则形状并且平铺于培养瓶底部，见图3；14 d后梭形细胞逐渐增多，形态为成纤维细胞状细胞，并且贴服于培养瓶的底部，脂肪细胞完全去分化，见图4。

图1 原代成熟脂肪细胞(×100)

图2 成熟脂肪细胞去分化4 d(×200)

图3 成熟脂肪细胞去分化10 d(×100)

图4 去分化脂肪细胞(×100)

2.2 细胞生长曲线及倍增时间 以每个时间点所测的2组各孔A值的算数平均值为纵坐标，以所测的时间为横坐标，用Excel 2003软件绘制出散点折线图，可以发现随着时间的变化A值随之增加，1～2 d 2组细胞为生长停滞期，指数生长期从第3天开始，均在第6天进入平台生长期。曲线大致呈“S”形，2组细胞生长的总体趋势变化不大，见图5。经计算对照组细胞的倍增时间约为60.96 h，减弱组倍增时间约为59.70 h，组间进行单因素方差分析，P=0.982，差异无统计学意义，表明缝隙连接通讯减弱剂18α-GA对去分化脂肪细胞生长增殖无显著影响。

图5 2组DA的生长曲线

2.3 茜素红钙结节染色 镜下观察可见2组细胞均有被染成紫红色的钙结节，见图6和图7。

图6 减弱组DA诱导14 d茜素红染色(×100)

图7 对照组DA诱导14 d茜素红染色(×100)

2.4 SLDT法检测GJIC的强弱 结果显示减弱组为4～5层，见图8；对照组为7～8层，见图9。

2.5 Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色 染色后镜下观察发现2组胞浆内均有棕黄色颗粒沉积，见图10及图11；对灰度值进行统计学分析，减弱组为134.551±7.301，对照组为125.497±9.230，2组比较有显著性差异(P<0.05)。

2.6 Western blot技术检测Cx43蛋白的表达 Cx43蛋白的相对分子量为45×103，减弱组的条带要弱于对照组并且颜色较浅，见图12。测得整合光密度值减弱组为44158.92±1 356.94，对照组为48 519.19±1 678.5，2组比较有显著性差异(P<0.05)。

图8 SLDT法检测减弱组荧光黄扩散距离(×100)

图9 SLDT法检测对照组荧光黄扩散距离(×100)

图10 减弱组DA诱导14 d Ⅰ型胶原免疫组化

图11 对照组DA诱导14 d Ⅰ型胶原免疫组化

3 讨 论

GJIC广泛存在于人体的各个系统中，目前研究比较多并取得一定进展的有神经系统和心血管等系统，成骨细胞和脂肪细胞间也存在广泛的缝隙连接，连接介导的GJIC对2种细胞的代谢、生长、增殖及分化起到非常重要的作用，而此两种细胞存在相同的表型，改变GJIC可能影响脂肪细胞向成骨细胞的转换。

图12 Western blot技术检测Cx43蛋白的表达

GJIC的组成单位为缝隙连接蛋白(Cx)，通过调控Cx的生成、Cx的转运及连接子的耦联情况，可以调节缝隙连接的数量，从而调控GJIC。GJIC在维持细胞间信息的传递，调节细胞增殖、分化及维持组织内环境的稳态等过程中起着十分重要的作用[2-3]。目前研究发现，18α-GA[4]、油酸酰胺、生胃酮等对GJIC有减弱作用。有研究表明，成骨细胞和骨细胞中主要表达Cx43[5]，而Cx43与骨骼的正常发育密切相关，Cx介导的GJIC在骨骼发育、塑形中扮演尤为重要的角色[6]，可通过调节成骨细胞的增殖、分化及存活等生物学过程而影响骨骼的发育、塑形[7]。

本实验选用Western blot技术检测成骨细胞中Cx43蛋白的表达，发现减弱组Cx43的量明显少于对照组，说明18α-GA对GJIC具有调控作用，通过改变Cx的生成和转运使其在细胞与细胞之间产生了更少的缝隙连接结构。直观的SLDT法检测GJIC功能，发现单位时间内减弱组LY的扩散细胞层数明显少于对照组，说明细胞与细胞之间产生更少的缝隙连接结构的基础上，可以使单位时间细胞与细胞之间的信息交换量明显减少。

成熟的脂肪细胞在缺氧缺营养的培养条件下能够去分化为成纤维样细胞，这种细胞在成骨诱导环境下具有分化为成骨细胞的能力[8]。因此本研究选用3月龄新西兰大白兔，提取成熟脂肪细胞。成熟脂肪细胞采用天花板贴壁法在缺氧缺营养环境下进行培养，镜下观察到成熟的脂肪细胞第4天开始逐渐脱去脂滴，10 d左右去分化成功得到高纯度去分化脂肪细胞。通过MTT法检测发现18α-GA对去分化脂肪细胞向成骨诱导过程中对细胞增殖无显著影响。另外钙结节为成骨细胞进入成熟期的标志[9]，成骨细胞的成熟在骨形成的过程中至关重要。本实验中2组细胞于诱导2周后行茜素红钙结节染色，均有钙结节被染成了紫红色，说明成骨诱导脂肪细胞成功分化为成骨细胞，并能聚集钙离子，促进细胞外基质矿化，使成骨细胞进入了成熟期。而I型胶原是成骨细胞分化

过程中的早期标志之一，在骨发育中I型胶原起重要作用，I型胶原缺失会造成成骨细胞发育停滞。本实验结果显示减弱组胞浆内I型胶原含量少于对照组，这说明减弱GJIC可以产生更少的Ⅰ型胶原，减慢骨基质重建进程。

综上所述，成熟的脂肪细胞能够去分化并且得到了去分化脂肪细胞，去分化脂肪细胞在成骨诱导环境下能够横向分化为成骨细胞，并能使之进入成熟期，参与成骨过程。而GJIC减弱剂18α-GA可通过调控Cx 的生成、Cx 的转运及连接子的耦联，减弱缝隙连接结构的形成，从而减少缝隙连接的数量，使得细胞与细胞间的信息传递减少，进而减慢了去分化脂肪细胞向成骨细胞横向分化的速度，分化成了更少的成骨细胞并减慢了成骨细胞的成熟和骨质重建。说明影响GJIC能够影响脂肪细胞向成骨细胞分化。下一步将探讨是否可以通过增强GJIC来加速和促进脂肪细胞向成骨细胞的横向分化，以期达到治疗和预防骨量减少性疾病，为临床开发新药提供新的理论和依据。

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Effects of GJIC diminuendo agent 18α-GA on transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts in rabbits

Wang Jibo, Zeng Xuan, Peng Hao, Wang Fengyu, Wang Zhaojie

(Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Zhuhai 519041, Guangdong, China)

Objective It is to explore the effects of transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts and gap junction intercellular communication(GJIC) by gap junction Diminuendo agent 18α-GA. Methods Groin adipose tissue was taken from 3 months old New Zealand White Rabbit and collected mature adipocytes. Made the mature adipocytes dedifferentiate and obtained the dedifferentiated adipocytes. The 3rd generation of the dedifferentiated adipocytes were induced and differentiated into osteoblasts. There were two experimental groups that the diminuendo group with adding 18α-GA and the control group. The toxic action of 18α-GA in osteoblasts growth and proliferation were detected by MTT assay. Osteoblasts were qualitatively detected by alizarin red staining and collagen typeⅠ immunohistochemistry staining. The expressions of Cx43 were measured by Western-blot and sorape-loading and dye transfet (SLDT) method. Results The results of MTT assay showed that 18α-GA had no significant effect on cell proliferation. The results of Alizarin red staining showed that calcific nodules were dyed red in each group. Immunohistochemistry staining results showed that the expressions of collagen typeⅠ were weakened in the diminuendo group. The results of Western blot showed that the expressions of Cx43 were decreased in the diminuendo group. Conclusion 18α-GA diminuendo the capability of transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts with enhancement of GJIC.

adipocytes; osteoblasts; dedifferentiated; gap junction intercellular communication; 18α-GA

王吉博，男，硕士，助教，主要从事外科学教学及科研工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.009

R-332

A

1008-8849(2014)34-3793-04

2014-04-05