辛二酰苯胺异羟肟酸对裸鼠人宫颈癌移植瘤的作用及其机制

付鑫鑫，田志华，郝钢华，刘占稳，刘金，邢军

论著·基础

辛二酰苯胺异羟肟酸对裸鼠人宫颈癌移植瘤的作用及其机制

付鑫鑫，田志华，郝钢华，刘占稳，刘金，邢军

目的观察辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对裸鼠人宫颈癌移植瘤生长的抑制作用,并对药物作用机制进行探讨。方法培养人宫颈癌SiHa细胞接种至20只裸鼠右下肢背侧根部皮下,15 d后将成瘤的18只裸鼠随机分3组：空白对照组、SAHA1组(25 mg/kg)、SAHA2组(50 mg/kg)，每组6只。连续4 d腹腔注射药物，间歇7 d，再连续给药4 d，1次/d。观察各组裸鼠宫颈癌移植瘤的生长情况，计算抑瘤率。免疫组化分析及Western blot方法检测各组移植瘤中的Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果空白对照组抑廇率为0，SAHA1组为22.44%， SAHA2组为35.52%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。用药后，SAHA2组裸鼠体质量低于空白对照组及SAHA1组(P<0.05)。SAHA1组与SAHA2组肿瘤体积均小于空白对照组，且SAHA2组小于SAHA1组(P均<0.05)。与空白对照组相比，SAHA1组与SAHA2组裸鼠肿瘤质量低，且SAHA2组低于SAHA1组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；免疫组化及蛋白印迹法检测结果显示，与空白对照组比较，SAHA1组、SAHA2组Bax蛋白均明显升高，Bcl-2 蛋白均明显降低(P均<0.05)。而SAHA2组较SAHA1组变化更明显，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论SAHA可以有效抑制人宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤的生长，Bax/Bcl-2相关的细胞凋亡是其抑癌机制之一。

辛二酰苯胺异羟肟酸；宫颈癌 ；裸鼠；Bcl-2；Bax

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，其发生率及病死率居女性肿瘤前位。传统的抗癌手段——化疗，因其对正常细胞的毒副作用而限制了其抑癌效果。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)是一类以基因转录表达遗传调节为原理的新型抗癌试剂，作为一种新型癌症治疗药物蓄势待发。HDACI主要是通过改变组蛋白的乙酰化水平调整染色质结构，调控基因的表达以诱导肿瘤细胞生长阻滞，促进肿瘤细胞分化和凋亡等机制抑制癌症。辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)已用于临床治疗皮肤T细胞淋巴瘤，其对宫颈癌的作用也有相关的研究[1，2]，有研究报道，SAHA可能与诱导肿瘤细胞凋亡和调节相关基因表达有关[3]，具体机制有待进一步研究。本文通过SAHA作用于宫颈癌SiHa细胞系裸鼠移植瘤观察SAHA对宫颈癌的影响，研究其可能抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈鳞癌细胞株SiHa贴壁细胞购自北京协和细胞库。SPF级雌性(BALB/c)裸鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。试剂：SAHA(美国Cayman公司),顺铂(云南个旧生物药业有限公司)，Bax兔源单克隆抗体、Bcl-2兔源单克隆抗体、一抗及二抗抗体稀释液(北京博奥森生物有限公司)，SP试剂盒(北京四正柏试剂公司)，羊抗兔多克隆抗体(美国Earthox生物试剂公司)，β-actin(美国Santa cruz公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(杭州碧云天生物试剂公司)，蛋白分子量标准(北京拜尔迪生物技术公司)，DAB显色剂(北京中杉试剂公司)等。

1.2 细胞培养 将宫颈鳞癌细胞株SiHa贴壁细胞置入含100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养液,于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每2～3 d换1次新鲜培养基。0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化,收集并传代。选用对数生长期细胞进行实验。

1.3 异种移植裸鼠模型 配制3.2 ×107/ml SiHa宫颈癌肿瘤单细胞悬液，选择4～5周龄的雌性无胸腺裸鼠20只，皮下注射于裸鼠的近右侧下肢背侧根部。裸鼠于接种后的第15天成瘤，根据设定的入组标准：(1)移植瘤肿瘤直径约8 mm；(2)裸鼠精神、饮食、活动等一般情况良好；(3)接种处局部无感染征象，无其他器质性疾病，瘤体无缺血坏死征。去除2只成瘤未成功的裸鼠，随机分成空白对照组、SAHA 1组、SAHA 2组，每组6只，成瘤后开始腹腔注射用药。空白对照组：生理盐水0.2 ml；SAHA1组：SAHA (25 mg/kg)0.2 ml;SAHA2组：SAHA(50 mg/kg)0.2 ml ；第1、2、3、4天每日接受注射1次，停药7 d后再连续注射4 d，每日1次，共注射8次。SAHA粉剂250 mg用二甲基亚砜(DMSO)稀释成50 mg/ml的储存液充分溶解，使用时用生理盐水稀释配制不同浓度的工作液。

1.4 观测项目 每天观察评估裸鼠一般情况，包括裸鼠毛色、食欲及精神状态、体质量等。用药后第16天处死裸鼠，收集肿瘤组织，测量肿瘤质量，计算抑瘤率。将瘤体组织分成2份，一份置于 10%福尔马林中固定，然后石蜡包埋备用；一份液氮迅速冰冻，后转移至-80℃冰箱保存备用。

1.4.1 免疫组织化学法检测：采用链霉卵白素—生物素过氧化物酶法(SP法)检测移植瘤组织Bax及Bcl-2蛋白的表达。石蜡包埋，4 μm连续切片。根据免疫组化试剂盒说明书对切片进行染色，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析采用计数法，每张切片任意选取400倍光镜下6个完整视野内的阳性细胞数，计算平均值。结果判定：以染色分数评分(染色强度)评定：肿瘤细胞染成深棕色为强阳性3分，棕黄色为阳性2分，浅黄色为弱阳性1分，无着色为阴性0分。阳性细胞率评分：肿瘤细胞阳性率>70%～100%为3分，30%～70%为2分，10%～>30%为1分，<10%为0分。以染色分数评分×阳性细胞率评分即为染色指数。染色指数≥3分为阳性；<3为阴性[4]。

1.4.2 Western blot 分析：储存于-80 ℃的移植瘤组织样品于分析前在冰上解冻汇集，加入RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂，在冰上匀浆、澄清并进行标准的BCA蛋白测定分析后储存于-80 ℃下备用。从每组样品中取20 μg蛋白质，上样到预制的SDS-聚丙烯酰胺凝胶泳道，转移蛋白到PVDF膜。加一抗封闭膜，4℃ 孵育过夜， 洗膜后在室温下孵育于羊抗兔的二抗稀释液中1 h，洗膜30 min，用BCIP/NBT避光显色。β-actin做内参对照，结果扫描后以Image 分析软件计算出灰度值，分析蛋白表达的相对水平。

1.5 统计学方法 利用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 裸鼠移植瘤模型建立 接种15 d后18只裸鼠成瘤，肿瘤移植成瘤率为90%。用药期间观察各组裸鼠一般情况好，皮肤红润，进食饮水无明显变化。

2.2 抑瘤率比较 于用药结束后的第1天拉颈处死，称重瘤组织，计算抑瘤率=(空白对照组瘤重-实验组瘤重)/空白对照组瘤重×100%，各组的抑廇率分别为空白对照组0、SAHA1组22.44%、SAHA2组35.52%，各组间相比差异有统计学意义(P均<0.05)。

表1 3组裸鼠用药前后体质量、肿瘤体积、肿瘤质量比较

注：与用药前比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05；与SAHA1组比较，△P<0.05

2.3 体质量及肿瘤体积变化 用药前各组裸鼠体质量与肿瘤体积进行检验，差异均无统计学意义(P均>0.05)。用药结束后，空白对照组及SAHA1组体质量较用药前均明显增加(P均﹤0.05)，而SAHA2组裸鼠体质量较用药前无明显化(P>0.05)，且用药结束后，SAHA2组裸鼠体质量低于其他2组(P均<0.05)，用药前后测量肿瘤长径(a)、短径(b)，计算体积。用药结束后3组肿瘤体积较用药前增加，差异有统计学意义(P<0.05)。且用药后，与空白对照组相比，SAHA1组及SAHA2组肿瘤体积均缩小，且SAHA2组较SAHA1组肿瘤体积明显缩小(P<0.05)。见表1。

2.4 免疫组化检测移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白表达 Bax蛋白阳性表达主要位于胞质，阳性染色呈棕黄色，散在分布(图1见封3)。与空白对照组比较，SAHA1组、SAHA2组Bax表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。而SAHA2组较SAHA1组升高更明显(P<0.05)。Bcl-2蛋白阳性表达主要位于胞浆，阳性染色呈棕黄色，呈散在分布(图2见封3)。与空白对照组比较，SAHA1组、SAHA2组Bcl-2蛋白阳性表达显著降低(P<0.05)。而SAHA2组较SAHA1组降低更明显(P<0.05)。见表2。

表2 各组移植瘤中Bax、Bcl-2染色指数比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与SAHA1组比较，#P<0.05

2.5 蛋白印迹法检测移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白比较 在预染蛋白标准约21kDa见Bax特异性蛋白条带，26kDa处见Bcl-2特异性蛋白条带(见图3)。各组移植瘤组织中Bax及Bcl-2蛋白的检出率均为100%，与空白对照组比较，SAHA1组、SAHA2组Bax蛋白表达水平升高、Bcl-2蛋白表达水平降低(P均﹤0.05)，且SAHA2组较SAHA1组改变更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白灰度值的表达

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与SAHA1组比较，#P<0.05

图3 Western blot检测各组移植瘤中Bax、Bcl-2的蛋白表达

3 讨 论

宫颈癌作为常见的妇科恶性肿瘤，严重影响女性的生活质量，甚至威胁女性生命。宫颈癌治疗中化疗是作为辅助手术或放疗的主要手段，改善了无数肿瘤患者的预后，提高了生存期。但由于放疗对正常器官组织细胞的副损伤，化学药物常因缺乏靶标的选择性产生较为严重的不良反应、严重的耐药性等极大地限制了放疗照射及化学药物的应用剂量，限制了其作用效果，影响了临床疗效。

近年来，肿瘤治疗的研究方向主要倾向于研发新的药物，既可以改善目前化疗药物的缺陷，并且能保持强有力的抗癌活性。HDACI已经被证实具有广泛的抗肿瘤作用，对多种来源的肿瘤细胞，包括膀胱、骨、乳腺、中枢神经系统、食管、肺、卵巢、胰腺、前列腺等均表现出良好的杀伤效果[5]。HDACI通过抑制HDAC，纠正肿瘤细胞的异常乙酰化状态，复活沉默的基因抑制肿瘤发生发展。现已知的HDACI作用于肿瘤细胞的机制主要是：诱导细胞分化，阻滞细胞生长发育，促进细胞凋亡[6]，影响免疫和血管生成等。目前，有关HDACI对宫颈癌的抗肿瘤机制的研究较多，对其细胞信号传导通路、细胞周期调节及细胞凋亡等机制的研究也有了一定基础。本结果显示，低剂量的SAHA1组抑廇率为22.44%，高剂量的SAHA2组抑廇率为35.52%，用药结束后，SAHA1、SAHA2组体积均小于空白对照组，肿瘤质量也低于空白对照组，提示SAHA在体内可有效抑制SiHa宫颈癌移植瘤的生长。而且，高剂量的SAHA比低剂量SAHA作用显著。另外，在用药期间，各用药组裸鼠均无明显不适，精神、活动、饮食、二便等一般情况与空白对照组无明显差异，用药结束后裸鼠体质量与用药前相比无明显下降，这可能提示SAHA对患有宫颈癌的裸鼠无明显不良反应。以往也有研究发现SAHA在裸鼠体内对T淋巴细胞瘤、乳腺癌有抑制肿瘤生长的作用，且无明显不良反应[7，8]。

应用SAHA后裸鼠肿瘤组织Bax蛋白表达增加及Bcl-2蛋白表达减少。Bax/Bcl-2作为线粒体途径调控细胞凋亡的重要基因[9]，其比值决定着细胞受刺激后凋亡或存活。Bax/Bcl-2相关的凋亡途径是化疗药物、细胞毒性物质对外界应激条件下诱导细胞凋亡的主要途径，即线粒体途径。死亡信号激活Bax后，Bax从细胞浆移位到线粒体膜上，可通过自身形成同源二聚体，或通过与Bcl-2形成异源二聚体以失活Bcl-2抑制其作用，达到促进细胞凋亡的作用。当Bcl-2相对较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，消除Bax的促凋亡作用，因而其抑制细胞凋亡的作用增强，凋亡趋势减弱[10]；而当细胞内Bax蛋白表达相对较多时，则Bax本身形成的同源二聚体占主导，则促凋亡作用增强[11]。简单来说，就是Bax 优势时细胞凋亡，Bcl-2 优势时细胞存活。Meng等[12]用 Trichostatin A(TSA)作用于2种结直肠癌HT116细胞和HT29细胞，发现TSA可诱导促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL的表达，经减少线粒体膜电位和Caspase-3激活的线粒体途径引发细胞凋亡；Wang等[13]在应用过Sirtinol的人乳腺癌MCF 7细胞中观察到促进细胞凋亡，即上调Bax，下调Bcl-2以及细胞色素C释放到细胞质；Jeon等[14]发现MHY218,一种新的HDACI，可通过释放的细胞色素C增加Bax/Bcl-2 比例，激活Caspase-3引起的凋亡途径抑制人类卵巢癌细胞；Srivastava等[15]在移植了MDA-MB-468乳腺癌细胞的裸鼠体内，发现应用了MS-275的裸鼠肿瘤细胞中Bcl-2下降以及Bax增加。因而，可认为SAHA的抗癌作用与Bax/Bcl-2相关的细胞凋亡有关，关于SAHA对宫颈癌肿瘤的促凋亡作用尚未见报道。

综上所述，SAHA可抑制人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的生长，其机制与细胞凋亡有关，通过促进与Bax/Bcl-2相关的细胞凋亡途径，增加位于线粒体外膜的Bax蛋白的表达水平，下调释放到细胞质的Bcl-2蛋白水平，降低Bcl-2/Bax的比例，促进细胞凋亡。SAHA不良反应小，是一种相对安全有效的药物，可作为临床治疗宫颈癌的抗癌药继续研究。

1 He J,Huang C,Tong A,et al. Proteomic analysiSof cervical cancer cellStreated with suberonylanilide hydroxamic acid[J]. J Biosci，2008，33(5):715-721.

2 Jiang Y,Wang Y,Su Z,et al. Synergistic induction of apoptosiSin HeLa cellSby the proteasome inhibitor bortezomib and histone deacetylase inhibitor SAHA[J]. Mol Med Rep，2010，3(4):613-619.

3 MitsiadeSCS,Poulaki V,McMullan C,et al.Novel histone deacetylase inhibitorSin the treatment of thyroid cancer[J]. Clin Cancer Res,2005,11(10):3958-3965.

4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养[M]. 2版. 西安：世界图书出版社,2007:160-180.

5 CaneSD,Chiang GJ,Billmeyer BR,et al. Histone deacetylase inhibitorSupregulate plakoglobin expression in bladder carcinoma cellSand display antineoplastic activity in vitro and in vivo[J]. Int J Cancer,2005,113(5):841.

6 曹振平,凌斌,冯定庆.去乙酰化酶抑制剂抗肿瘤作用研究进展[J].国际妇产科学杂志,2010,37(4):267-270.

7 Sakajiri S,Kumagai T,Kawamata N,et al. Histone deacetylase inhibitorSprofoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines[J]. Exp Hematol， 2005，33(1):53-61.

8 Lee YJ,Won AJ,Lee J,et al. Molecular mechanism of SAHA on regulation of autophagic cell death in tamoxifen-resistant MCF-7 breast cancer cells[J]. Int J Med Sci， 2012，9(10):881-893.

9 Fan J,Li R,Zhang R,et al. Effect of Bcl-2 and Bax on survival of side population cellSfrom hepato cellular carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol,2007,13(45):6053-6059.

10 Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al，Bax activation and mitochon drial insertion during apoptosis[J]．Apoptosis，2007，12(5)：887-896．

11 Yin XM，Wang K,GrosSA,et a1．Bid-deficient mice are resistant to fas-induced hepatocellular apoptosis[J]．Nature,1999，400(6747)：886-891．

12 Meng J,Zhang HH,Zhou CX,et al. The histone deacetylase inhibitor trichostatin A induceScell cycle arrest and apoptosiSin colorectal cancer cellSvia p53-dependent and -independent pathways[J]. Oncol Rep， 2012， 28(1):384-388.

13 Wang J,Kim TH,Ahn MY,et al. Sirtinol,a clasSIII HDAC Inhibitor,induceSapoptotic and autophagic cell death in MCF-7 human breast cancer cells[J]. Int J Oncol， 2012，41(3):1101-1109.

14 Jeon HS,Ahn MY,Park JH,et al. Anticancer effectSof the MHY218 novel hydroxamic acid-derived histone deacetylase inhibitor in human ovarian cancer cells[J]. Int J Oncol， 2010， 37(2):419-428.

15 Srivastava RK,Kurzrock R,Shankar S. MS-275 sensitizeSTRAIL-resistant breast cancer cells,inhibitSangiogenesiSand metastasis,and reverseSepithelial-mesenchymal transition in vivo[J]. Mol Cancer Ther，2010，9(12):3254-3266.

InhibitioneffectsofSAHAonhumancervicalcancercellsinnudemicexenografts

FUXinxin*,TIANZhihua,HAOGanghua,LIUZhanwen,LIUJin,XINGJun.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,HebeiUnitedUniversityAffiliatedHospital,Tangshan063000,ChinaCorrespondingauthor:XINGJun,E-mail:mdxj2012@163.com

ObjectiveTo observe the tumor growth inhibition effect of SAHA to human cervical cancer transplanted in nude mice and to discusSthe mechanism.MethodsCultured human cancer cell lineSin nude mice inoculated to 20 dorsal rootSof the right lower limb subcutaneous,15 d after the tumor will become 18 mice were randomly divided into three groupSwith each included 6 mice:blank control group,SAHA1 group (25 mg/kg),SAHA2 group (50 mg/kg). Consecutive 4d intraperitoneal injection of drugs,intermittent 7 d,and then continuously administered 4 d,1 times/d. Observe the growth of cancer xenograftSin nude mice in each group,the inhibition rate waScalculated. Immunohistochemistry and Western blot analysiSwaSused to detect the expression of tumor in each group Bax and Bcl-2 protein.ResultsTumor suppression in blank control group waS0,SAHA1 group waS22.44%,SAHA2 group waS35.52% ,the two groupSwaSstatistically significant difference (P<0.05). After treatment,SAHA2 group nude body masSwere lower than the blank control group and SAHA1 group (P<0.05). After treatment,SAHA1 group SAHA2 tumor volume waSlesSthan the blank control group,and the SAHA2 group waSlesSthan SAHA1 group(P<0.05). Compared with the blank control group,SAHA1 group and SAHA2 nude mice'StumorSwith low quality,and SAHA2 group lower than SAHA1 group,the differenceSwere statistically significant (P<0.05);in immunohistochemistry test and protein blotting method,compared with blank control group,tumor tissue Bax protein in SAHA1 group and SAHA2 group were significantly increased,Bcl-2 protein were significantly lowered (P<0.05). the changeSin SAHA2 group were more obviouSthan SAHA1 group (P<0.05).ConclusionSAHA can inhibit human cancer xenograft SiHa cell growth,Bax/Bcl-2 -related apoptosiSiSone of the tumor suppressor mechanism.

Suberoylanilide hydroxamic acid; Cervical cancer; Nude mice; Bcl-2; Bax

063000 唐山，河北联合大学附属医院妇产科(付鑫鑫、刘金、邢军); 062552 任丘市华北石油总医院二部 医院妇产科(田志华、郝钢华)；任丘市人民医院妇产科(刘占稳)

邢军，E-mail:mdxj2012@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.023

2013-11-19)