甘肃省18种药用植物病毒病调查及2种病毒病的鉴定

刘 雯， 晏立英， 文朝慧， 陈秀蓉*

(1.甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 兰州 730070; 2. 中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;3.甘肃出入境检验检疫局, 兰州 730010)

调查研究

甘肃省18种药用植物病毒病调查及2种病毒病的鉴定

刘 雯1， 晏立英2， 文朝慧3， 陈秀蓉1*

(1.甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 兰州 730070; 2. 中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;3.甘肃出入境检验检疫局, 兰州 730010)

2012年6月至2013年9月对甘肃省宕昌县、漳县、岷县、渭源县、陇西县、临洮县等地区种植的具有疑似病毒病症状的半夏等18种药用植物进行调查及采样。采用黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、芜菁花叶病毒(TuMV)等7种双抗体夹心免疫酶联检测(DAS-ELISA)试剂盒初检,并对CMV和ToMV采用反转录PCR(RT-PCR)方法复检,结果表明,半夏、掌叶大黄和红花3种药用植物受到黄瓜花叶病毒(CMV)侵染；马兜铃、土贝母及当归3种植物受到番茄花叶病毒(ToMV)侵染；样品中未检测到上述其他病毒种类,其余12种病毒样品的病原尚未确定。本研究为国内首次报道CMV病毒侵染掌叶大黄、红花,ToMV病毒侵染马兜铃、当归和土贝母。此研究为防治上述病毒病提供了依据。

药用植物; 病毒病; DAS-ELISA; RT-PCR

甘肃省是全国重要的药材生产大省之一,2009年中药材种植面积达到全国的三分之一[1]。甘肃省中药材种植分布广、种类多、产量大,丰富了甘肃的农业结构,是农业生产经济收入的又一来源,在许多地区已成为当地的支柱产业[2]。但随着种植面积的扩大,病害连年发生,日趋严重。甘肃省关于中药材病害的研究,主要集中在真菌病害上,中药材病毒病鲜见报道。目前国内文献报道了侵染半夏、当归及地黄3种植物的病毒种类,侵染半夏的病毒有芋花叶病毒(Dasheenmosaicvirus, DMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)和大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus, SMV)[3-4]；侵染当归的病毒有马铃薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)[5]；侵染地黄的病毒有烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、地黄退化病毒(Dihuangdegenerationvirus, DDV)、蚕豆萎蔫病毒(Broadbeanwiltvirus, BBWV)[6-7]等。

关于植物病毒病毒源的检测鉴定,目前主要有生物学方法、电镜法、血清学方法和分子生物学方法。其中血清学方法具有特异性好、操作简便、检测周期短的特点,但在准确性和灵敏度方面还有一定的缺陷；分子生物学方法具有特异性强、灵敏度高的特点,能够弥补血清学方法的缺点[8]。国内外文献关于植物病毒的检测主要采用血清学和分子生物学技术相结合的办法,其中双抗体夹心酶联免疫吸附法(double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)和反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是使用最多的方法[9-10]。

本研究对甘肃省宕昌县、漳县、岷县、陇西县、渭源县和临洮县6县种植的党参、栝楼、红花及藿香等18种药用植物上疑似病毒病症状样品进行了调查和采样,并通过DAS-ELISA及RT-PCR进行检测鉴定,确定其病毒种类,旨在为甘肃省药用植物病毒病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集时间及地点

2012年7月至2013年9月对甘肃宕昌县阿坞乡、哈达铺镇、官鹅沟药材园,漳县大草滩,岷县麻子川,渭源县会川镇,陇西首阳药材示范园,临洮县玉井镇、南河乡等地的疑似病毒病症状的半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit]、土贝母(Cyanotisvaga(Lour.)Roem.)、当归[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]、党参[Codonopsispilosula(Franch)Nannf.]、地黄[Rehmanniaglutinosa(Gaert.)Libosch.exFisch.etMey.]、栝楼(Trichosanthessp.)、红花(CarthamustinctoriusLinn.)、藿香[Agastacherugosa(Fisch.etMey.)O.Kuntze]、马兜铃(AristolochiadebilisSieb.etZucc)、射干[Belamcandachinensis(Linn.)DC.]、玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)、天仙子(HyoscyamusnigerLinn.)、刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms]、芍药(PaeonialactifloraPall.)、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、款冬花(TussilagofarfaraLinn.)、山药(DioscoreaoppositaThunb.)、掌叶大黄(RheumpalmatumLinn.)共18种药用植物进行采集、症状描述并拍照,采集的样品置于-80 ℃冰箱保存备用,通过检测确定这些植物是否含有病毒,并确定病毒的种类。

1.1.2 试剂

DAS-ELISA检测试剂盒及阳性对照购自美国Agdia公司,检测的病毒种类包括黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus, AMV)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus, ToMV)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、马铃薯X病毒(PotatovirusX, PVX)和芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus, TuMV)等7种。

植物总RNA 提取试剂盒购自天根公司；One step RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司,其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

分别称取不同症状的药用植物的叶片3.0 g,加入3倍体积的PBST缓冲液,充分研磨后装入离心管中,然后3 000 r/min离心5 min,上清液用于DAS-ELISA检测,另取300 μL上清液按照RNA提取试剂盒说明提取植物总RNA。

1.2.2 血清学检测

采用DAS-ELISA方法,按照试剂盒说明书,对植物提取液进行检测,每个样品设计两孔重复,并设计阴性和阳性对照,每孔加入100 μL待测样品,显色后用芬兰雷柏酶标仪在405 nm波长下测吸光值。当样品吸光值与阴性对照吸光值的比值≥2时,判定结果为阳性。

1.2.3 RT-PCR检测

1.2.3.1引物设计

参照已发表的文献中[11-12]报道的CMV、ToMV CP基因的特异引物序列合成引物CMVF:5′-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3′,CMVR:5′-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3′;ToMVF:5′-CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG-3′,ToMVR:5′-ATTAAGGGAAAAVCACT-3′用于检测CMV、ToMV的CP基因片段。

1.2.3.2RT-PCR扩增

以植物总RNA为模板按照TaKaRa One Step RT-PCR 反应试剂盒说明书配制25 μL反应体系：2×Step Buffer 12.5 μL,Enzyme Mix 1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL, RNase Free H2O 8 μL,植物总RNA模板1.5 μL。CMV RT-PCR扩增反应条件：50 ℃反转录30 min; 94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存；ToMV RT-PCR扩增反应条件：50 ℃反转录30 min; 94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 54 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。反应结束后取10 μL用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物,含有目的条带的RT-PCR产物送金唯智生物公司测序。

1.2.3.3序列比对和系统发育树的构建

将获得的CMV和ToMV序列与NCBI上同源序列进行BALST比对后,下载同源序列,用Clustal(Version 1.81)进行多重序列匹配排列(multiple alignments)分析,形成一个多序列匹配排列阵,然后用Mega(Version 5.0) 通过邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树[7-8]。

2 结果与分析

2.1 药用植物病毒病的症状

对采集的18种药用植物的疑似病毒病样品进行检测,其中有6种植物检测到病毒,其相应症状及发生危害情况描述如下。

半夏病毒病：发病初期叶脉颜色正常,叶肉组织变为黄色,褪绿不均匀,主要表现绿斑驳花叶,叶片边缘向上卷曲；有些叶片叶缘出现锯齿状；有些叶片基部皱缩、畸形及全株矮缩、死亡；有些产生黄色条斑及明脉,见图1a～b。此病发生危害重,在各地种植区普遍发生,许多田块几乎全田发病,是目前半夏生产中危害最重的病害。

土贝母病毒病：发病初期在叶片上出现隐约可见的轻微花叶,叶脉透明,出现明脉,后期叶片绿色出现明显可见的疱斑花叶；有些叶片有黄色环斑,见图1c。此病在调查的土贝母田均有发生,危害较重,是土贝母的主要病害之一。

图1 几种中草药病毒病的症状

当归病毒病：发病初期,仅上部叶片出现隐约可见的轻微花叶,逐渐出现黄绿不规则的疱斑花叶,叶片略变硬变脆；有少数叶片表现蕨叶,见图1d。此病在调查区域均有发生,但危害较轻。

红花病毒病：发病后幼叶皱缩明显,叶片仍为绿色,老叶出现黄化,逐渐由叶尖向叶基部黄化,老叶皱缩不明显,见图1e。此病在红花田发生较轻。

掌叶大黄病毒病：在叶片上出现明脉,幼叶皱缩明显,出现黄绿不均匀的花叶,老叶叶肉组织浓绿,但在靠叶脉处有轻微褪绿现象,后发展为疱斑花叶。有少数叶片上有环斑。发病严重时,叶片畸形,见图1f～g。在掌叶大黄上发生较轻。

马兜铃病毒病：病株叶片一般稍小,叶片感病后有些出现叶肉组织黄化、浅绿和深绿不规则的花叶；有些叶片出现黄绿疱斑和明脉见图1h～j。是马兜铃上的常见病害,但危害较轻。

2.2 血清学测试结果

DAS-ELISA检测结果表明,18种中药材植物中红花样品的CMV检测值与阴性对照的比值大于2,呈现阳性；马兜铃、当归及土贝母的ToMV检测值与阴性对照的比值大于2,呈阳性(表1)。18种中草药的TuMV、AMV、PVY、PVX、TMV的检测值与阴性值比均小于2,检测结果为阴性。初步确定红花携带有CMV病毒,马兜铃、当归、土贝母携带有ToMV病毒。

2.3 RT-PCR检测结果

2.3.1 电泳检测结果

根据上述检测结果,进一步采用RT-PCR检测18种药用植物中是否含有CMV和ToMV。电泳检测结果可看出,半夏、掌叶大黄和红花3种植物在776 bp处出现了与CMV阳性对照大小一致的条带,检测结果呈阳性(图2a)；马兜铃、土贝母及当归均在686 bp处出现了与ToMV阳性对照大小一致的条带,检测结果为阳性(图2b)；其他中草药均未检测出任何条带。

表1中草药CMV及ToMV的DAS-ELISA检测结果

Table1DAS-ELISAdetectionofCMVandToMVonmedicalherbs

样品SampleCMV检测值A405A405反应类型ReactiontypeToMV检测值A405A405反应类型Reactiontype阳性对照Positivecontrol0．210+0．958+阴性对照Negativecontrol0．087-0．081-半夏Pinelliaternata0．102-0．076-掌叶大黄Rheumpalmatum0．085-0．076-红花Carthamustinctorius1．639+0．096-马兜铃Aristolochiadebilis0．090-0．218+当归Angelicasinensis0．106-0．182+土贝母Cyanotisvaga0．100-0．182+

1) +: 阳性反应; -: 阴性反应 +: Positive; -: Negative

图2 几种中草药的RT-PCR检测

2.3.2 序列分析及系统发育树构建

ELISA和RT-PCR检测结果表明半夏、掌叶大黄、红花携带有CMV病毒,马兜铃、土贝母、当归携带有ToMV病毒,选取具有代表性的植物红花、马兜铃进一步测序和BLAST分析,结果表明,红花上CMV(CMV-HH-1分离物)序列(登录号JX878884.1)与已报道的CMV序列(登录号Z12818.1,tobacco,M21464.1,cucumber,U22822.1)同源性达98%,选取NCBI登陆的CMV CP基因氨基酸序列,进一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通过邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。从进化树构建结果(图3)可以看出,CMV-HH-1是CMV亚族Ⅱ株系。从分子水平上进一步确定半夏、掌叶大黄及红花植物上携带有CMV病毒。马兜铃上ToMV长度为686 bp,经BLAST分析,与已报道的ToMV序列(登录号DQ873692.1,tomato,AB355139.1,tobacco,AJ429085.1,Lycopersiconperuvianum)同源性达98%,选取NCBI登录的ToMV烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、烟草轻绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)CP基因氨基酸序列,进一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通过邻接法构建系统发育树。从进化树构建结果(图4)可以看出,该病毒(MDL分离物)是ToMV株系。从分子水平上进一步确定,马兜铃上携带有ToMV病毒。

图3 红花CMV-HH-1分离物与部分CMV分离物CP基因氨基酸序列同源性分析

3 讨论

通过DAS-ELISA方法检测到红花含有CMV病毒,马兜铃、当归、土贝母含有ToMV,与RT-PCR方法检测结果一致；用DAS-ELISA方法对半夏、掌叶大黄样品进行CMV病毒检测的结果为阴性,但通过RT-PCR方法在该样品中检测到CMV,可能是由于半夏、掌叶大黄样品中病毒含量较低,受DAS-ELISA灵敏度限制所致。这与郭巧萍[13]报道的DAS-ELISA方法灵敏度不够高,不能完全检测出半夏上的CMV病毒的结果相一致。相比之下,RT-PCR方法的检测灵敏度更高、特异性更强[14-15],本研究利用RT-PCR在核酸水平上证明了病毒的存在。

图4 马兜铃MDL分离物与部分ToMV分离物CP基因氨基酸序列同源性分析

利用已购买的7种病毒检测试剂盒对18种中草药进行检测,初步检测到6种药用植物上携带的病毒,剩下12种未检测到病毒,还需要后期继续其他种类病毒的检测鉴定。本研究中掌叶大黄、红花上检测到CMV病毒,马兜铃、当归、土贝母上检测到ToMV病毒尚属国内首次报道。其中当归受ToMV侵染后主要表现出花叶和蕨叶的症状，除张玉[2]报道的当归受PVY侵染后叶片呈现斑点的症状以外，未见其他关于当归病毒病及症状的报道。建议后期工作对上述几种植物中的病毒进行电镜观察、生物学接种等深入系统的研究。

本研究初步检测出甘肃地区中草药病毒病的病毒种类主要有CMV和ToMV。CMV、ToMV为常见植物病毒,发生普遍、寄主范围广,经济危害严重；其中CMV能侵染85科1 000多种单、双子叶植物,能够通过种子、繁殖材料和蚜虫传播[16]；ToMV能侵染茄科、十字花科等许多科植物,能够通过种子、机械损伤和蚜虫传播[17]。其他5种病毒未检测到,其原因是由于未被这5种病毒侵染,还是由于采集的标本数量有限,有待进一步研究。由于甘肃省药用植物种植面积大,种植地区比较固定,种植时间久,繁殖方法多以无性繁殖为主,致使病毒病的发生较重,如果不及时进行控制,病毒病会逐年加重造成严重损失[1]。繁殖无毒种苗、加强田间管理、使用防虫网防止蚜虫等害虫、不与其他作物混种等措施可有效防止病毒病的发生。本研究初步对甘肃地区中草药病毒病的种类进行了确定,对病害防治和脱毒苗生产提供了重要依据。

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Surveyofvirusdiseaseson18speciesofmedicalherbsinGansuProvinceandidentificationoftwovirusdisease

Liu Wen1, Yan Liying2, Wen Zhaohui3, Chen Xiurong1

(1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,PrataculturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.OilCropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430062,China;3.GansuExit-EntryInspectionandQuarantineBureau,Lanzhou730010,China)

Eighteen species of medical herbs showing virus-like symptoms were surveyed for the occurrence of viruses in Gansu Province.Cucumbermosaicvirus(CMV),Alfalfamosaicvirus(AMV),Tobaccomosaicvirus(TMV),Tomatomosaicvirus(ToMV),PotatovirusY (PVY),PotatovirusX (PVX), andTurnipmosaicvirus(TuMV) were detected in leaf samples by DAS-ELISA. The ELISA results showed that CMV was onPinelliaternata,RheumpalmatumandCarthamustinctoriusand ToMV was onAristolochiadebilis,BolbostemmapaniculatumandAngelicasinensis. Their presence was confirmed by RT-PCR with amplification of 776 bp and 686 bp fragments of the coat protein genes, respectively. Sequence analysis of viral amplicons demonstrated Gansu isolates had high (98%) nucleotide sequence identities with other CMV and ToMV strains. It is the first report of CMV infectingR.palmatumandC.tinctoriusand ToMV infectingA.debilis,B.paniculatum, andA.sinensisin China.

medical herbs; plant virus disease; DAS-ELISA; RT-PCR

2013-10-31

：2014-02-12

甘肃省中药材产业科技攻关项目(GYC11-01)；国家质检总局科技计划项目(2012IK270);甘肃出入境检验检疫局科技计划项目(2011GK001)

S 435.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.025

* 通信作者 E-mail: chenxiurong@gsau.edu.cn