土荆芥花序和叶挥发油的抑菌作用及组分分析

陈利军， 智亚楠， 王国君， 史洪中

(信阳农林学院农业科学系, 信阳 464000)

土荆芥花序和叶挥发油的抑菌作用及组分分析

陈利军*， 智亚楠， 王国君， 史洪中

(信阳农林学院农业科学系, 信阳 464000)

采用水蒸气蒸馏法分别提取采自河南信阳的土荆芥花序和叶的挥发油，采用GC-MS进行组分分析，并测定挥发油的抑菌作用。结果表明：土荆芥花序和叶的挥发油的含油率分别为4.02%和1.64%；GC-MS从挥发油中分别分离到10个和9个组分，均鉴定出7个组分，占挥发油总量的98.431%和99.103%；挥发油的主要组分均为驱蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，但相对含量差异较大；叶和花序的挥发油对小麦赤霉病菌具有强烈的熏蒸抑制作用，EC50分别为1.46 μL/皿和1.80 μL/皿。

土荆芥; 挥发油; GC-MS分析; 抑菌作用; 不同部位

土荆芥(ChenopodiumambrosioidesL.)为藜科一年生或多年生草本植物[1]，含丰富的挥发油。多项研究显示土荆芥挥发油具杀虫[2-5]、抑菌[6-9]、杀线虫[10]、抗氧化[6]等生物活性，挥发油易挥发的特性使土荆芥挥发油有望作为仓储、设施农业、土壤等的熏蒸剂防控病、虫、线虫等的为害。原产于热带美洲的土荆芥，现广泛分布于世界热带及温带地区[1]，在河南信阳也是常见的杂草，不同产地土荆芥挥发油化学组分和活性差异较大[5,7-9,11]，同一种植物的不同部位挥发油的含量、组分也不同[12]。已研究证明从产自河南信阳的新鲜土荆芥提取的挥发油对植物病原真菌具有极强的熏蒸抑制作用[13]。为了进一步掌握河南信阳土荆芥不同部位挥发油的含量、组分及抑菌活性，本研究采用水蒸气蒸馏法提取土荆芥花序和叶片的挥发油，测定干品的含油率，采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析挥发油的化学组分，并以小麦赤霉病菌为目标菌，测定了挥发油的抑菌活性，以期为土荆芥在农业上的开发应用提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

土荆芥花序和叶：供试土荆芥全草于2012年8月下旬采自信阳市震雷山，室内分花序和叶，自然风干(10～12 d)后，剪为不超过0.5 cm的小段。

植物病原真菌菌株：小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，由信阳农林学院植物病理实验室分离保存。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1 000 mL)。

主要仪器与设备：Agilent 6850/5975气质联用仪(GC-MS)，NIST05谱库。

1.2 土荆芥花序和叶挥发油的提取

精确称量样品，采用水蒸气蒸馏法，连续提取2 h，得浅黄色具浓郁气味的油状液体，即挥发油，计算含油率，重复3次。挥发油4 ℃冰箱保存备用。含油率(V/W)的计算公式如下：

含油率(%)=挥发油体积×100/样品重量。

1.3 挥发油熏蒸抑菌作用测定

对小麦赤霉病菌菌丝生长的熏蒸抑制作用测定采用生长速率法：在直径90 mm的培养皿中加入15 mL融化的PDA培养基(约60 ℃)，摇匀制成厚薄均匀平板，平板中央接种一块直径为5 mm的植物病原真菌菌饼。然后在皿盖上放置一灭菌的直径11 mm圆形滤纸片，吸取一定剂量的挥发油滴加到滤纸片上。皿底皿盖对扣，parafilm封口膜密封，25 ℃培养，72 h后观察植物病原真菌的生长情况，并采用十字交叉法测量病原真菌菌落直径，计算抑菌率。挥发油的剂量设7个处理，分别为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0 μL，以仅放一滤纸片不滴加挥发油为对照，重复3次。

抑菌率(%)=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)×100/对照菌落生长直径；

根据生物统计概率换算表，将抑菌率换算成概率值，以概率值(Y)为纵坐标、挥发油剂量的对数值(X)为横坐标建立毒力回归方程，利用方程求得概率值为5和6.2816时的剂量即为EC50和EC90值。

1.4 挥发油GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升温，柱初温60 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升温速率升至90 ℃，再以10 ℃/min升温速率升至180 ℃，载气为高纯氦气，流量1.0 mL/min，进样量1.0 μL。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围33～350 amu。

2 结果与分析

2.1 土荆芥花序和叶挥发油的含油率

采用水蒸气蒸馏法提取土荆芥花序和叶的挥发油，含油率分别为4.02%和1.64%。

2.2 土荆芥花序和叶挥发油组分GC-MS分析

分别对土荆芥花序和叶的挥发油组分进行GC-MS分析，总离子流图见图1。利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对含量，所得质谱图经NIST05质谱数据库检索，并与标准图谱核对,分别从土荆芥花序和叶的挥发油中分离出10个和9个组分(表1)，其中花序挥发油中鉴定出了7个组分，占总成分的98.431%，叶挥发油中鉴定出了7个组分，占总成分的99.103%。从表1可以看出土荆芥花序和叶的挥发油组分基本相同，但相对含量差异较大。两者挥发油主要组分均为驱蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，其中相对含量最高的组分均为驱蛔素，相对含量分别为40.284%和34.425%。

表1土荆芥花序和叶的挥发油化学成分1)

Table1ThechemicalconstituentsoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioides

峰号No．保留时间/mintR化合物Compounds分子式Formula相对含量/%Relativecontent花序Flower叶Leaf15．531α⁃松油烯α⁃TerpineneC10H1615．81723．38625．610p⁃伞花烃p⁃CymeneC10H147．7004．714313．335未鉴定Unknown0．6780．375414．1352⁃蒈烯2⁃CareneC10H1628．16023．567514．898未鉴定Unknown0．4850．522615．446未鉴定Unknown0．406-717．737驱蛔素AscaridoleC10H16O240．28434．425818．0263⁃甲基⁃4⁃异丙基酚3⁃Methyl⁃4⁃isopropylphenolC10H14O2．9735．375918．328麝香草酚ThymolC10H14O2．9245．3671028．135邻苯二甲酸异丁基辛酯Phthalicacid，isobutyloctylesterC20H30O40．5752．269

1) -：无 -: n/a

图1 土荆芥花序和叶挥发油的GC-MS总离子流图

2.3 对小麦赤霉病菌的熏蒸抑制作用

以生长速率法在90 mm培养皿中测定土荆芥花序和叶的挥发油对小麦赤霉病菌的熏蒸抑制作用，结果见图2、表2。从表2可看出，土荆芥花序和叶的挥发油对供试菌种菌丝生长都有一定的熏蒸抑制作用，抑制作用随剂量增加而增强。在相同剂量条件下，叶的挥发油对小麦赤霉病菌的熏蒸抑制活性比花序挥发油的活性高。2.5 μL/皿的剂量，叶挥发油的抑制率达到78.64%，花序挥发油的抑制率达到64.55%。5 μL/皿和10 μL/皿的剂量对小麦赤霉病菌的抑制率均达到100%。

图2 土荆芥花序和叶挥发油对小麦赤霉病菌的熏蒸抑制作用

表2土荆芥花序和叶挥发油对小麦赤霉病菌菌丝生长的熏蒸抑制作用

Table2FumigationantifungalactivityofessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction抑制率/%Inhibitoryratio0．5μL/皿1．0μL/皿1．5μL/皿2．0μL/皿2．5μL/皿5．0μL/皿10μL/皿花序Flower4．5528．1839．0955．4564．55100．00100．00叶Leaf5．4535．0051．3663．1878．64100．00100．00

表3为72 h后土荆芥花序和叶的挥发油对小麦赤霉病菌菌丝生长的熏蒸作用毒力测定结果，根据毒力回归方程计算EC50和EC90。结果表明，挥发油对小麦赤霉病菌的毒力回归方程具有很好的相关性，表现出明显的正相关，即随着浓度不断增加,挥发油对供试病原菌抑制活性逐渐增强。土荆芥花序和叶的挥发油均有强烈的抑菌作用。叶的挥发油活性较高，EC50仅为1.46 μL/皿，EC90为3.59 μL/皿；花序挥发油的EC50为1.80 μL/皿，EC90为4.98 μL/皿。

表3土荆芥花序和叶挥发油对小麦赤霉病菌菌丝生长的毒力测定结果

Table3ToxicityoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction毒力回归方程(Y=)Regressionequationofantifungalactivity相关系数CorrelativecoefficientEC50/μL·皿-1EC90/μL·皿-1花序Flower2．8990X+4．26030．98601．804．98叶Leaf3．2828X+4．45840．98721．463．59

3 结论与讨论

采自河南信阳的土荆芥花序含油率为4.02%，远高于叶的含油率1.64%，也高于果实的含油率2.48%(数据另文发表)。而土荆芥茎的含油率极低，因此未被列入本研究对象。

GC-MS从土荆芥花序和叶挥发油中分别分离到10个和9个组分，其中均有7个组分被鉴定，分别占其挥发油总量的98.431%和99.103%。土荆芥花序和叶挥发油的组分基本相同，但相对含量差异较大。花序挥发油的主要成分为驱蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，相对含量分别为40.284%、28.160%和15.817%；而叶挥发油的主要成分及相对含量高低顺序与花序相同，其相对含量分别为34.425%，23.567%和23.386%，即α-松油烯的相对含量高于花序，驱蛔素和2-蒈烯的相对含量低于花序。驱蛔素、2-蒈烯和α-松油烯也在多地土荆芥的挥发油中检测到，或是相对含量较高的成分[5,14]。

土荆芥花序和叶的挥发油对小麦赤霉病菌均有强烈的熏蒸抑制作用，且叶的挥发油活性较高，EC50为1.46 μL/皿。前人对土荆芥挥发油抑菌活性测定多采用平板给药[6-7]，如Jardim等测定了采自巴西的土荆芥挥发油对8种采后真菌(Aspergillusspp.，Colletotrichumspp.，Fusariumspp.等)的抑制活性，结果显示，PDA培养基挥发油浓度为0.3%时，完全抑制所有真菌的生长，浓度为0.1%时，抑制率在90%～100%间[7]。因挥发油的易挥发性，更有利于通过熏蒸作用起到生物抑制活性，所以本研究测定的是土荆芥花序和叶挥发油的熏蒸抑菌作用。

多项研究证实土荆芥挥发油具有抑制真菌活性[6-7,9-13]，作用于真菌后，菌丝体结构被破坏、原生质体凝集、蛋白质缺失或增加[9]，驱蛔素是主要的抑菌化合物[7]。p-伞花烃、麝香草酚等化合物也具有抑制真菌活性[7-15]。本研究土荆芥花序和叶挥发油组分含量最高的化合物均为驱蛔素，p-伞花烃和麝香草酚的相对含量之和均大于10%。土荆芥花序和叶的挥发油的强烈的熏蒸抑菌作用可能源于其含有多种抑菌物质，且相对含量很高。土荆芥花序和叶的挥发油抑菌机制及单体组分在抑制真菌活性中的作用有待进一步研究。

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TheantifungalactivityandchemicalconstituentanalysisofessentialoilsfromflowersandleavesofChenopodiumambrosioides

Chen Lijun, Zhi Yanan, Wang Guojun, Shi Hongzhong

(DepartmentofAgriculturalSciences,XinyangCollegeofAgricultureandForestry,Xinyang464000,China)

Essential oils from the flowers and leaves ofChenopodiumambrosioidesL. in Xinyang City of Henan Province were extracted by steam distillation, and their chemical constituents were analyzed by GC-MS. The antifungal activity of essential oils was also studied. The results showed that the yields of essential oils from the flowers and leaves were 4.02% and 1.64%, respectively. Ten and 9 constituents were isolated, and 7 constituents were identified, accounting for 98.431% and 99.103% of the total essential oils from the flowers and leaves by GC-MS, respectively. The main chemical constituents of all essential oils were ascaridole, 2-carene and α-terpinene, but the relative contents varied. The essential oils from leaves and flowers showed strong fumigation antifungal activity toFusariumgraminearum, with an EC50value of 1.46 μL/dish and 1.80 μL/dish, respectively.

Chenopodiumambrosioides; essential oil; GC-MS analysis; antifungal activity; different parts

2013-11-18

：2013-12-28

河南省科技攻关项目(122102310257)；信阳市科技攻关项目(130016)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.007

* 通信作者 E-mail: chlijun1980@163.com