牡丹皮、黄连、大黄提取物对松材线虫生理代谢的影响

焦宏伟， 张 璐， 刘 东， 赵宝华

(河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024)

牡丹皮、黄连、大黄提取物对松材线虫生理代谢的影响

焦宏伟， 张 璐， 刘 东*， 赵宝华*

(河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024)

对3种中草药黄连、牡丹皮、大黄的乙醇提取物毒杀松材线虫作用机制进行了初步研究。测定了其对线虫体内总糖和蛋白含量的影响，处理前后线虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和乙酰胆碱酯酶(AChE)酶活性变化和丙二醛(MDA)含量变化，处理前后SOD、CAT、GSH-Px和AChE表达量变化； 并用松枝水培试验测定3种提取物对松材线虫病害的防控效果。结果表明，提取物处理后线虫体内总糖及蛋白含量显著下降，线虫体内糖及蛋白质的代谢受到干扰；线虫体内SOD、CAT、GSH-Px酶活性提高，POD活性显著下降，MDA含量升高，表明线虫体内氧化与抗氧化作用失衡，细胞功能受到极大影响；AChE活性被抑制，表明线虫的神经系统受到破坏，SOD、CAT、GSH-Px和POD表达量与酶活性变化基本一致。松枝水培试验表明中药提取物能够有效控制松材线虫病害发生。综上，3种提取物引起的松材线虫体内众多生理指标的改变是造成线虫死亡的主要原因。

中草药提取物； 松材线虫； 生理代谢

松材线虫病是通过松墨天牛携带松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，Steiner & Buhrer)在松树间相互传播而引起的一种特大毁灭性病害[1-2]。松材线虫寄生在松树体内取食营养而导致树木萎蔫并迅速枯死，因其蔓延迅速，防治难度极大，引起疫区的恐慌而被称为“松树癌症”，“无烟的森林火灾”[3-4]。此病自1905年被发现、1934年被报道以来，已广泛分布于全世界多个国家[5]。目前对松材线虫病的防治多采用化学防治、轮作及抗病品种的选育，但效果均不太理想，且存在众多弊端[6]。目前使用的化学杀线虫剂多为高毒性、高残留，与环境相容性差，对土壤微生物、植物、水源和大气层造成严重污染或破坏，而且在植物体内残留的药物会直接危害人类健康[7-9]。因此，开发环境友好型、对人类和生态环境安全的杀松材线虫剂成为重要研究课题[10]。目前对松材线虫病防治的研究逐渐倾向于从天然植物中寻找更有效、更安全的杀线虫活性物质。植物源农药具有毒性较低、与环境相容性好、无残留、害虫不易产生抗性等特点，符合绿色环保的要求，因此越来越受到人们的重视[11]。国外在利用植物提取物防治植物寄生线虫方面的研究较多，目前已发现多种植物来源的杀松材线虫物质[12-15]。近些年在我国，植物杀线虫剂的研究也逐渐成为了热点[16-17]。翁群芳、钟国华等采用28种植物提取物进行杀线虫试验，发现多种具有杀线活性的物质，并对其生理活性和生理效应进行了测定[18-19]。巨云为等利用万寿菊、亚菊和银杏的提取物进行杀线虫试验，获得明显效果，并且经毒性测试发现从万寿菊中提取出的135种馏分中24种对松材线虫具有毒杀活性[20]。松材线虫的防治从生态学和生产实践出发也需要高效、安全、低毒的植物源杀线剂。目前研究主要集中在杀线虫植物的调查以及杀线活性筛选等方面，但有关杀线虫机理方面还不是很清楚，有待进一步研究[21-22]。作者在前期进行的具有杀松材线虫活性中草药的筛选与研究中发现，牡丹皮、黄连、大黄提取物对松材线虫及其虫卵具有良好的毒杀活性。本研究初步确定了3种中草药对松材线虫生理代谢的影响，为松材线虫病的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与松材线虫

供试中草药：牡丹皮(Cortex Moutan Radicis)、黄连(Coptis Chinensis Franch)和大黄(Radix et Rhizoma Rhei)购买于河北省石家庄市锦绣大地药业公司。

供试线虫：松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)，由河北师范大学动物学实验室提供。松材线虫用以PDA培养基培养的多毛孢菌(Cordycepssinensis)饲养(26 ℃),至线虫长满平板，置于4 ℃保存。使用时先将含有线虫的培养基挑出，放入贝氏漏斗中，无菌水冲洗，将流出液浓缩配制成50 条/μL的线虫液。

1.2 中药活性成分的分离与提取

乙醇粗提物的提取：分别称取3种中草药细粉末各200 g，加入95%乙醇室温下进行浸泡处理，乙醇浸液2 d更换1次。将连续浸泡提取3次后的提取液先用400目网筛过滤1次，然后再对提取液进行抽滤以去除残渣。70 ℃回流、提取24 h，使用旋转蒸发仪对提取液进行减压浓缩，得到黏稠状提取物，放4 ℃冰箱中备用。

1.3 供试线虫处理方法

采用浸渍处理法测定3种提取物对松材线虫的毒力[23]。准确称取3种中药粗提物适量，统一配制成浓度为100 g/L的溶液。在1.5 mL 离心管中放入浓度为 10 g/L的3种提取物1 mL，以及100 μL 松材线虫液(约5 000 条),同时以无菌水处理为对照，每处理重复4次, 置于26 ℃培养箱中处理24 h。

1.4 线虫体内总糖及蛋白含量测定

将浸渍处理后的线虫于2 000 r/min离心5 min，去除浸渍液后，沉淀用无菌水反复冲洗、离心(3 500 r/min，4 min)3 次。用1.5 mL 低温预冷的匀浆介质对线虫进行匀浆，低温离心(5 000 r/min，15 min)取上清，得到10 %的组织匀浆液。总糖含量测定采用蒽酮法；蛋白质含量测定采用Bradford法进行测定，利用紫外分光光度计在波长为595 nm处测量吸光值(A595)。

1.5 线虫体内保护性酶酶活性测定

本研究采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、过氧化物酶(POD)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒，按照说明书要求进行测定。

1.6 乙酰胆碱酯酶(AChE) 活性测定

采用南京建成生物工程研究所生产的测试盒，参照说明书要求进行测定。

1.7 丙二醛(MDA)含量测定

采用南京建成生物工程研究所生产的丙二醛(MDA)测定试剂盒，采用硫代巴比妥反应(TBA)染色法进行。

1.8 松材线虫体内相关酶的Western blot检测

SOD、CAT、GSH-Px和AChE的4种兔抗人多克隆抗体与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自Proteintech Group。首先按照1.4所述方法得到经过3种提取物处理的松材线虫虫体蛋白，将蛋白样品进行SDS-PAGE后，电转印至PVDF膜上，加入4种一抗和标记二抗，以四甲基联苯胺(TMB)为生色底物显色，进行蛋白印记分析。

1.9 松枝水培试验

采集1～2 年生，胸径约30 cm 健康马尾松(PinusmassonianaLamb.)松枝，参照文献[24]方法进行松枝水培试验。

用清水分别将制备所得3 种中药提取物配制成250 μg/mL溶液，准确取250 mL 药液装入500 mL三角瓶中，将大小基本一致的供试健康松枝插入药液中。瓶口用保鲜膜密封。采用截枝套管法接种线虫：选取离体松枝侧枝，在离主枝约5 cm 处削去枝梢，使截面朝上，在截面基部缠绕少许脱脂棉，套上长度约8 cm 的乳胶管，用细绳扎紧乳胶管基部，从管口注入线虫悬浮液，接种量1 000 条/枝。然后用湿润的脱脂棉塞住管口，以维持乳胶管内湿度，便于线虫侵入。分别设“提取物水培枝+线虫”、“水培枝+线虫”和“水培枝”对照试验3组。每处理重复3次。

接入松材线虫后每10 d 观察松枝外部症状，松枝病情分级标准如下：0 级，松枝正常，针叶绿色；1 级，1/4 以下针叶发黄；2 级，1/4～3/4 针叶发黄；3 级，3/4 以上针叶发黄，1/2 以下针叶枯萎；4 级，1/2 以上针叶枯萎，松枝濒死或死亡。按下式计算病情指数，比较各处理病害严重程度。其中Xi为各病级的松枝数，ai为各病级，amax为最高病级4[19]。

病情指数=Σ(Xi×ai) / Σ(Xi×amax)×100。

1.10 数据统计

采用SPSS 16.0 for Windows 和 Excel 软件进行统计，所得数据均用平均数±标准误差表示，用Duncan新复极差法比较差异显著性(P<0.05)；比值计算为处理值/对照值。

2 结果与分析

2.1 对松材线虫体内总糖及总蛋白含量的影响

3种提取物对松材线虫体内总糖及总蛋白含量影响的测定结果见表1。经处理后，松材线虫体内总糖含量相比对照明显降低，大黄处理组甚至降低了50 %左右；总蛋白含量相比对照水平降低更加明显，黄连处理组甚至降低了80 %。这表明3种提取物严重干扰了线虫体内的糖代谢和蛋白代谢，造成线虫体内总糖及总蛋白含量的显著降低，这可能是造成线虫死亡的重要原因。

表1 3种提取物对松材线虫体内总糖及总蛋白含量的影响Table 1 Effects of the extracts of three TCM herbs on the contents of total sugar and protein in B.xylophilus

2.2 提取物对松材线虫体内保护性酶活性的影响

线虫体内的超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)能够清除自由氧自由基，从而保持体内的活性氧浓度平衡。因此检测线虫体内3种酶的活性可以间接反映体内氧自由基水平。

3种提取物对松材线虫体内保护性酶活性影响的测定结果见表2。经提取物处理后，线虫体内保护性酶活性均有明显变化，与对照水平相比：SOD与CAT酶活性提高，黄连提取物处理后的效果最为明显。这表明3种提取物处理能够明显影响线虫体内氧自由基代谢，提高氧自由基含量，从而造成线虫体内保护性酶活性提高。而POD酶活力则明显降低，牡丹皮处理组甚至降低了90%左右。POD酶活力的降低使得线虫体内保护系统失去作用，从而使得活性氧浓度失衡，造成虫体损伤。

表2 3种提取物对松材线虫体内保护性酶活性的影响Table 2 Effects of the extracts of three TCM herbs on the activity of protective enzymes in B.xylophilus

2.3 对线虫体内神经靶标酶及GSH-Px活性的影响

乙酰胆碱酯酶(AChE)是神经传导中的一种关键酶，在神经传导中起关键作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的分解过氧化物的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化物的还原反应。经中药提取物处理后，GSH-Px酶活显著升高，为对照的2倍左右，表明提取物使线虫体内产生大量有毒的过氧化物代谢物，对线虫细胞造成损伤，结果见表3。

表3 3种提取物对乙酰胆碱酯酶与谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响Table 3 Effects of the extracts of three TCM herbson the activity of AChE and GSH-Px in B.xylophilus

2.4 对松材线虫体内相关酶表达量的影响

3种提取物对松材线虫体内酶表达量的影响测定结果见图1。共检测了4种酶的蛋白表达情况。经Western-blot检测得到图谱，线虫体内3种保护性酶， GSH-Px、CAT和SOD的表达量均明显提高，AchE表达量明显降低，结果与酶活测定结果基本保持一致。

2.5 对松材线虫体内丙二醛含量的影响

丙二醛(MDA)是氧自由基引起的脂质过氧化物的降解终产物，具有强烈的氧化作用，能引起细胞的损伤、老化和死亡。因此检测MDA含量可间接反映线虫体内氧自由基的水平。3种提取物对线虫体内MDA含量影响的测定结果见表4。经提取物处理后，线虫体内MDA含量明显升高，黄连组甚至提高至对照水平的5倍。这表明提取物能够影响线虫体内氧自由基代谢，MDA的含量显著提高，引起线虫细胞的损伤。

图1 中药提取物对松材线虫体内多种酶基因表达量的影响Fig.1 Effects of the extracts of three TCM herbs on gene expression of the enzymes in B.xylophilus

表4 3种提取物对线虫体内丙二醛含量的影响Table 4 Effects of the extracts of three TCMherbs on the concentration of MDA in B.xylophilus

2.6 松枝水培试验结果

松枝水培试验结果表明，3种中药提取物250 μg/mL(无菌水配制)处理后40 d 内松枝均不发病,病情指数为0，与水培枝(CK)的病情指数相同。“水培枝+线虫”处理组 10 d 后开始出现针叶失水病情，处理13～15 d后，松枝尖端迅速变红，萎蔫，15 d时病情指数达到70，30 d后松枝全部变成红褐色，萎蔫坏死，病情指数为100，与翁群芳等[18-19]报道的现象相似。结果表明 3 种中药提取物能够明显阻止及延缓松材线虫引起的松树萎蔫病的发生与发展。结果见表 5 所示。

表5 3种提取物松枝水培试验处理对松材线虫的控制作用Table 5 Effects of the extracts of three TCM herbsagainst B.xylophilus in water-potted pine branches

3 讨论

目前国内外对于黄连、牡丹皮、大黄等中草药的研究主要集中于医药领域，而对其在农林业害虫防治方面的研究鲜见报道。在前期研究中，作者对36种中草药杀线虫活性进行筛选，确定了3种中药乙醇提取物对松材线虫及虫卵的毒杀活性[25]。为了进一步揭示中药提取物对松材线虫的生理活性和作用机制，我们进行了深入研究。

松材线虫常以灰霉菌(Botrytiscinerea)、小长喙霉(Ophiostomaminus)和长喙壳菌(Ceratocystisspp.)等真菌的菌丝为食[26]，这就表明一种理想的杀松材线虫药物应当具备抑真菌和杀线虫双重活性。但目前为止还没有一种此类双功能杀线虫剂投入使用。虽然一些化合物如酒石酸莫仑太尔(morantel tartrate)、阿维菌素(abamectin)和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)已被用于防治松材线虫病[27-29]，但是由于它们水溶性差、防治效果不理想以及成本过高等问题，使用并不广泛。因此一种理想的松材线虫病防治药物应当易溶于水、具备抑真菌与杀线虫双重活性，这样不仅对线虫有毒杀作用并且能够杀灭线虫的食物来源真菌[30]。根据这一研究思路，Oh等建立了一种高通量筛选方法，筛选到具有杀线活性的206种活性化合物，其中一种编号HWY-4213，化学名为“1-n-undecyl-2-[2-fluorphenyl]methyl-3,4-dihydro-6,7-dimethoxy-isoquinolinium chloride”的小檗碱衍生物具有良好的毒杀松材线虫和抑真菌活性[31]。黄连中的小檗碱是黄连的主要活性物质，含量高达5.20%～7.69%，因此我们确认黄连中的小檗碱是黄连的主要杀线活性物质。

糖类的重要作用是为生物体提供生命活动所需要的能量，目前早已证明线虫体内含有多种糖类物质[32]，总糖含量的降低表明线虫的营养情况正在逐步恶化。有文章报道选取牛心朴子中活性物质处理线虫后，造成线虫总糖含量的下降，影响了线虫的新陈代谢[33]。

松材线虫体表有一层由脂质蛋白组成的角质层，可起到防御细菌或有害物质入侵、阻止水分蒸发等作用从而保护线虫[32]。经中药提取物处理后的死亡线虫体表出现囊泡状结构(如图2a所示)、内部组织收缩、体壁分离等症状(如图2b所示)，这很可能是由于中药提取物抑制线虫体内蛋白质的产生或者破坏蛋白特定结构，进而影响线虫体内脂质蛋白角质层的正常功能，使内含物外泄，最终导致线虫死亡。

图2 松材线虫组织结构形态改变示意图Fig.2 Morphological changes of B.xylophilus

自由基具有很强的生物活性，很容易与生物大分子反应，直接损害或者通过一系列氧化链式反应引起广泛的生物结构破坏，导致细胞凋亡[34]。本研究发现，SOD、POD、CAT的活性以及MDA的含量可间接反映松材线虫体内氧自由基水平。经3种提取物处理后，线虫体内SOD和CAT活性与表达量及MDA含量均明显提高，这表明线虫体内存在着大量的氧自由基，而POD的活性却被抑制，这可能会使线虫体内氧化与抗氧化作用失衡，细胞的功能受到极大影响，最终导致线虫死亡。

研究表明，线虫能够产生2种谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px，一种分泌到线虫体表，能够清除体表有害的大分子过氧化物和脂肪酸过氧化物，保护线虫；另一种在细胞内，能够清除代谢产生的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[35]。经3种提取物处理后，线虫GSH-Px活性显著提高，表明线虫受到了大量过氧化物及代谢产物的损伤。

AChE在神经传导中执行着重要的功能，该酶能够降解乙酰胆碱，终止神经递质对于突触后膜兴奋刺激作用，保证神经信号分子在生物体内正常的传导，是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标[36]，而且还是细胞凋亡的潜在标记和调节因子之一[37]。经3种提取物处理后，松材线虫体内的AChE活性及表达量明显降低，导致神经递质无法正常降解，造成突触后膜的持续兴奋，最终导致线虫死亡。这可能是中药毒杀松材线虫的另一重要原因。

经3种提取物处理后，松材线虫体内AChE、GSH-Px、CAT和SOD的活性与其表达量呈现正相关性，因此我们初步推测中药提取物作用于线虫，使其体内产生了大量的氧自由基，从而诱发线虫体内各种保护性酶的表达发生变化并改变其活性，最终导致线虫死亡。在今后的研究中我们将从分子角度探究各种酶表达量变化的原因与机制,对此观点加以验证。

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EffectsoftheextractsofCortexMoutanRadicis,CoptisChinensisFranchandRadixetRhizomaRheionphysiologicalmetabolismofBursaphelenchusxylophilus

Jiao Hongwei, Zhang Lu, Liu Dong, Zhao Baohua

(CollegeofLifeSciences,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050024,China)

The objective of this study is to identify the poisoning mechanism of the ethanol extracts of three traditional Chinese medicinal herbs, Cortex Moutan Radicis, Coptis Chinensis Franch and Radix et Rhizoma Rhei, againstBursaphelenchusxylophilus. The effects of these extracts were evaluated on the metabolism of total sugar and protein and activities of protective enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), glutathione peroxidase (GSH-Px), acetylcholinesterase (AChE), and the content of malondialdehyde (MDA) fromB.xylophilus. The gene expression of SOD, CAT, GSH-Px and AChE was also analyzed. The control effects of the extracts onB.xylophiluswere measured in water-potted plants. The extracts of three TCM herbs interfered with the metabolism of total sugar and protein ofB.xylophilus. The activities of SOD, CAT, and GSH-Px were improved; the activity of POD was inhibited; MDA content was increased. Oxidation and antioxidation were imbalance, which greatly affected cell functions. The activity of AChE was inhibited, and the nervous system was damaged. The level of SOD, CAT, GSH-Px and AChE was consistent with enzyme activity. The results revealed that the extracts can effectively control the pine wood nematode disease. It is concluded that the changes of some physio-biochemical indexes ofB.xylophilusinvivocaused by the extracts of three TCM herbs were the main causes of its death.

Chinese herb extract;Bursaphelenchusxylophilus; physiological metabolism

2014-01-03

：2014-05-12

河北省自然科学基金项目(C2013205103)，河北师范大学博士基金项目(L2010B10)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.004

* 通信作者 E-mail:刘东 liudong410@163.com；赵宝华 zhaobaohua86178@sohu.com