京郊番茄主要病毒病毒原鉴定

田兆丰， 刘伟成， 张涛涛， 董 丹， 罗 晨

(北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097)

京郊番茄主要病毒病毒原鉴定

田兆丰， 刘伟成， 张涛涛， 董 丹， 罗 晨*

(北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097)

近年来，番茄病毒病，特别是番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病在北京地区空前暴发，给番茄生产造成严重威胁，使番茄的产量和品质显著降低。2012-2013年在北京周边7个区县，采集疑似感染病毒的番茄植株样品325份，分别针对TYLCV、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)3种病毒进行了PCR或ELISA 检测。检测结果表明，目前在北京地区大棚或温室内发生的番茄病毒病以TYLCV为主；露地番茄病毒复合侵染现象比较普遍，病毒检出率100%， 其中TYLCV检出率达到75%以上。在TYLCV侵染的样品中，TYLCV和CMV复合侵染占20%左右，TYLCV和TMV复合侵染占15%左右。部分样品检测到TYLCV、 CMV 和TMV 3种病毒复合侵染的现象。

番茄; 病毒病; 鉴定

番茄是重要的蔬菜作物，病毒病对番茄的危害一直都是番茄生产的重要制约因素。引起番茄病毒病的毒原有20多种，主要有烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)和马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)[1-2]。20世纪90年代以来，由于气候变暖和种植结构的变化，导致烟粉虱传播的双生病毒在全球范围内大面积扩展和蔓延。在我国，影响番茄生产的主要病毒也由烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒演变为由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)，并在近几年来形成暴发性危害[3-6]。

番茄黄化曲叶病毒病在番茄生产中是一种毁灭性病害，由番茄黄化曲叶病毒引起。该病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)，菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒，在自然条件下只能由烟粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植物DNA病毒[7]。该病毒在番茄、木薯和烟草等重要经济作物上危害严重，在世界许多国家造成了巨大的经济损失[8]。

番茄黄化曲叶病毒1991年在我国广西南宁市郊已有零星发生[5]，之后由南至北逐步扩展蔓延，危害日益严重，2005-2010年在全国多个省市发展蔓延并有逐年加重的趋势[6，9-11]，其发生危害程度与烟粉虱的发生程度相关。番茄黄化曲叶病毒2009年在北京首次报道[12]，之后在北京周边地区迅速蔓延开来，并在2009-2010年造成严重危害[13-14]，给菜农带来巨大经济损失。本课题组在工作实践中发现，相对于保护地番茄，露地番茄病毒病的发生更为复杂，往往不只一种毒原，因此，于2012-2013年对北京周边区县的保护地和露地番茄栽培品种主要病毒病的发生情况进行了较为系统的调查，以期为病毒病的症状识别、毒原种类的鉴定、病毒病的防治和育种工作提供指导。

1 材料和方法

1.1 番茄样品的采集

在2012年4月-2013年5月，分别于朝阳、大兴、顺义、怀柔、延庆、房山、密云等7个郊区县的长子营、魏善庄、榆垡、青云店、大孙各庄、长哨营、韩村河、蟹岛、小丰营、长阳、不老屯等地采集番茄样品共计325份，样品采集后当日或次日进行检测，或放于袋内在4 ℃保存，并在1周内进行检测。

检测TYLCV所用的阳性对照和健康对照番茄品种均为‘佳粉18号’。 阳性对照采自北京市房山区韩村河，健康对照番茄在试验温室的养虫笼内培养；经PCR检测，确定阳性样品感染了TYLCV，健康样品未感染TYLCV。

1.2 番茄黄化曲叶病毒的PCR检测

1.2.1 番茄病叶总DNA的提取

采用天根公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒，每个样品取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨后提取，具体操作方法按天根生化科技有限公司试剂盒提供的操作步骤进行。最后将DNA洗脱在150 μL洗脱缓冲液(TE)中，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR检测

按TYLCV基因组特异性保守序列设计PCR引物序列TYLCV-R：5′-CCA ATA AGG CGT AAG CGT GTA GAC-3′和TYLCV-F：5′-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3′,并由北京三博远志生物技术有限公司合成，以提取的植物基因组总DNA为模板进行PCR扩增； PCR扩增体系为:模板<1 μL, TYLCV-R和TYLCV-F(10 μmol/L)各1 μL,2×Master Mix 12.5 μL,加ddH2O至终体积为20 μL。PCR反应程序：预变性94 ℃ 2 min;变性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 45 s、 延伸72 ℃ 30 s，32个循环;最后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。从PCR产物中取5 μL，以1.0%琼脂糖凝胶(含Gold View)电泳分离，在凝胶成像系统上观察结果，扩增序列大小约为 543 bp。

1.3 烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒的血清学鉴定

TMV、CMV的ELISA检测采用双抗体夹心(DAS-ELISA)检测法。具体步骤参照安德珍生物技术(北京)有限公司ELISA试剂盒提供的步骤并稍作修改,使用酶联检测仪在405 nm波长下读取吸光值A405。阴阳性指标： 样品A405≥2倍健康样品A405为阳性，样品A405<2倍健康样品A405为阴性。

2 结果与分析

2.1 番茄样品TYLCV病毒PCR检测结果

图1是部分番茄样品的PCR检测结果，其中生产上常见的感病品种‘仙客6号’的电泳条带十分明显，而生产上常用的抗病品种‘浙粉701’的条带非常微弱。

图1 部分番茄样品的PCR检测凝胶电泳结果Fig.1 PCR results for some tomato samples

不同地点番茄样品的详细检测结果见表1。在这次调查中，北京周边的7个区县均有TYLCV的发生，无论是抗病还是感病品种均检测到TYLCV的侵染，但不同品种间症状有所区别，病毒检出率也有差异。TYLCV在感病品种上的症状比较典型，如‘仙客6号’发病初期新生叶由叶缘开始黄化，顶部叶片褪绿发黄、变小，随后黄化区域向中脉扩展，最后整个叶片枯黄，边缘上卷，同时还伴随植株矮化，开花结果受阻；而多数抗病品种症状比较轻微，如‘浙粉701’，只是新叶呈现脉间失绿或花叶，与感病品种的症状差异较大，而与烟草花叶病毒引起的症状相似。

在不同地点采集的番茄感病品种‘仙客6号’、‘金棚1号’显症样品的病毒检出率均为100%，而抗病品种如‘浙粉701’、‘浙粉702’的症状不典型，有部分样品未检测到病毒。总体来看，在北京的大棚或温室内，番茄黄化曲叶病毒病的发生还是比较严重和普遍的。

表1 京郊地区保护地番茄TYLCV侵染的PCR检测结果Table 1 PCR results of TYLCV on tomato plants in the greenhouse in Beijing suburbs

2.2 番茄样品TYLCV、TMV、CMV复合侵染的检测鉴定

露地番茄病毒病发病症状比较复杂，部分是由几种病毒复合侵染造成。表2是对TYLCV、TMV、CMV 3种病毒复合侵染情况的检测鉴定结果。

待测样品采自露地番茄，其番茄病毒病的症状复杂、多样，有些番茄的不同部位分别表现有蕨叶、花叶、黄化或坏死等症状。总体来看，感染TYLCV的症状主要表现为叶缘黄化合并卷曲;感染CMV主要表现为叶片蕨叶，而感染TMV主要表现为花叶、锈斑或坏死。由表2可见，TYLCV、CMV、TMV有2种甚至3种病毒复合侵染同一植株的现象，不同病毒特有的症状在同一植株上可以同时有所表现。如2、9号样品组的植株同时表现了叶缘黄化和蕨叶，就是典型的TYLCV和CMV复合侵染后的症状，其样品也同时检测到了2种病毒的存在；检测结果还发现， 2、9号样品组虽然都测出了TYLCV和CMV，但这2组样品中TYLCV的PCR条带十分微弱，证明其病毒含量较低，这应当是复合侵染中2种病毒在营养和空间上相互竞争的结果；15号样品组也表现了TYLCV和CMV 2种病毒复合侵染的症状，但15号样品组的个别样品只检测出了TYLCV，还有个别样品只检测出了CMV。

表2 京郊露地番茄TYLCV、TMV、CMV复合侵染的检测鉴定结果1)Table 2 Testing results for TYLCV, TMV and CMV mixed infection on tomato plants in Beijing suburbs

1) “+”，表示样品A405≥2倍健康样品A405，为阳性；“-”，表示样品A405<2倍健康样品A405，为阴性。
“+”indicated the positive results(whenA405for detected sample≥2×A405for healthy sample); “-”indicated the negative results(whenA405for detected sample <2×A405for healthy sample).

由检测结果可见，露地番茄样品病毒病检出率100%， 其中TYLCV检出率达到75%以上。在TYLCV侵染的样品中，TYLCV和CMV复合侵染占20%左右，TYLCV和TMV复合侵染占15%左右。部分样品检测到TYLCV、 CMV 和TMV 3种病毒复合侵染的现象。

3 讨论

过去几十年中，我国发生的番茄病毒病以TMV、CMV、PVY、PVX为主[1-2]，自1991年番茄黄化曲叶病毒在广西南宁发生以来[5]，逐步扩展蔓延，至今已经上升为番茄上最严重的病毒病害。在这次调查的7个区县的温室大棚中TYLCV的发生率在90%以上,发病率60%～100%，CMV、TMV发生率为20%～30%，发病率10%左右。

番茄病毒病的发生与气候、栽培条件等因素密切相关。烟草花叶病毒主要由农事操作接触传播，但种子和土壤均可带毒传播[15]，过去春季温室里的番茄以感染烟草花叶病毒TMV为主；黄瓜花叶病毒主要由蚜虫以非持久方式传播，也可机械传播，病毒可在多年生宿根植物或杂草上越冬，然后传播到番茄上[16]。温度高、光照强、干旱的条件利于蚜虫的繁殖和迁飞，因此利于CMV传播和扩散[17]，所以，秋晚番茄以感染CMV为主。目前，烟粉虱已经成为温室常年发生并较难防治的主要害虫，所以，温室内由烟粉虱以持久方式传播的TYLCV为常年发生的主要病毒病；在露地，由于传毒的昆虫介体比较复杂，TYLCV、CMV、TMV 3种病毒的发生情况有所变化，CMV或TMV的发生率、发病率均显著上升，而TYLCV的发生、发病率有所下降，而且有几种病毒复合侵染的现象。

在调查中发现，北京地区近年来已经开始栽种抗番茄黄化曲叶病毒的抗、耐病品种‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘浙杂301’、‘中杂101’等[18-19]，但在发病严重的地块仍可检测到病毒的侵染，不过发病症状较轻，发病率和病情指数都较低，对番茄的产量和品质影响较小；感病品种‘金棚1号’、‘仙客6号’等发病严重，发病率和病情指数都很高，目前栽培面积已经减少；抗病品种‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘中杂101’等栽培面积的扩大，对控制病情和阻止其蔓延起到了较好的效果。尽管如此，由于大棚、温室的连作栽培使番茄种植茬口相接，导致彻底灭虱和清园工作存在一定困难，这也给病毒病的防治带来一定的难度。

在露地番茄复合侵染现象中发现，当番茄植株同时被TYLCV、CMV或TMV侵染时，同一植株上可以同时出现不同种病毒的症状，这些症状不是混合出现而是在植株的不同部位分别出现，说明复合侵染的这几种不同病毒之间没有交叉保护作用，但在同一植株内仍然有空间竞争现象[20]。

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IdentificationofseveralmainvirusdiseaseoftomatoinBeijing

Tian Zhaofeng, Liu Weicheng, Zhang Taotao, Dong Dan, Luo Chen

(InstituteofPlant&EnvironmentProtection,BeijingAcademyofAgriculture&ForestrySciences,Beijing100097,China)

In recent years, tomato virus disease, especiallyTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) disease in Beijing area occurred seriously, and the yield and quality of tomato reduced significantly. During 2012-2013, suspected virus infection samples of tomato collected in seven districts around Beijing were detected by PCR or ELISA for TYLCV,Tobaccomosaicvirus(TMV) andCucumbermosaicvirus(CMV), respectively. The results showed that TYLCV disease was dominant in the greenhouse. In the open field, the mixed infection of several virus was common, with the total detection rate up to 100%, in which the positive rate for TYLCV was over 75%. In the TYLCV infected samples, the mixed infection for TYLCV and CMV accounted around 20%, and about 15% for TYLCV and TMV. Some samples were found to be infected by the three viruses simultaneously.

tomato; virus disease; identification

2013-12-24

：2014-03-22

公益性行业(农业)科研专项(201003065)；“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD19B00)；北京市自然科学基金(6122017)

S 436.412.11

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.025

* 通信作者 E-mail:luochen1010@163.com