大黄牡丹汤组方对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞凋亡的影响

张延英，汪永锋，张艳霞，李存祥，康万荣

(甘肃中医学院 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室 甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室，兰州 730000)

急性胰腺炎(acute Pancreatitis，AP)是一种由胰酶激活引起的常见急腹症之一，由于胰腺腺泡细胞内酶原异常激活，导致胰腺局部炎症反应，其发病急、病程快、并发症多、病情危重、死亡率高，中医将之归属于“结胸”“阳明腑实证”等范畴，用通里攻下治疗[1]。经中医临床应用证明，大黄牡丹汤组方(RPDP)具有清热解毒，通里攻下，活血凉血，消痞除满等功效，对AP有很好的疗效。近年来，有研究对细胞凋亡在急性胰腺炎发病中所起的作用进行了探索，但RPDP对实验性急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡的影响及其机制的研究较少。本研究将对一次口服给予RPDP后急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡情况及其机制进行观察。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级实验动物和屏障实验室均由甘肃中医学院提供，生产许可证号：SCXK(甘)2011-0001，使用许可证号:SYXK(甘)2011-0001；SPF雄性SD大鼠60只，体质量200～260 g。将60只SD大鼠随机分为药物作用12 h假手术(SO)组、模型组和RPDP组，药物作用24 h SO组、模型组和RPDP组，每组各10只。分别于RPDP治疗后12 h和24 h后处死大鼠并取材。

1.2 药物、主要试剂与仪器 RPDP由甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室制成生药浓度为4 kg/L的药液。牛磺胆酸钠、TUNEL试剂盒、血清淀粉酶、一氧化氮(NO)和诱生型iNOS测定试剂盒均购自兰州硕达生物技术公司。所需仪器设备由甘肃中医学院科研实验中心提供。

1.3 AP模型的建立、治疗和取材 SPF级SD大鼠分为药物作用12 h SO组、AP模型组和RPDP治疗组，药物作用24 h SO组、AP模型组和RPDP治疗组。SO组大鼠在开腹后仅轻轻翻动胰腺和胰胆管然后关腹。大鼠禁食，自由饮水12 h后，3%戊巴比妥麻醉下，经上腹部正中切口进入腹腔，提起胃、十二指肠，显露出胰腺，确认胆胰管，在其近端和远端均以动脉夹暂时结扎，将带有四号针头的1 mL注射器沿十二指肠壁浆肌层穿刺距离胆胰管开口0.3 mm处的胆管，注入3.5%的牛磺胆酸钠0.1 mL/100 g，以0.1 mL/min的速度注射完成，停留5 min，去除结扎线，指压穿刺点，查无漏胆，逐层关腹。对照组仅牵引胰腺和十二指肠后关腹[2]。术后10～15 min清醒后限制饮水，笼中自由活动。建立大鼠AP模型，造模后2 h灌胃，治疗组给予RPDP剂量为40 g/kg(10 mL/kg)灌胃1次，相当于成人剂量的20倍，模型组和SO组用等量的生理盐水灌胃1次。给药后12 h和24 h两个时间段麻醉股动脉取血,每只动物分两个采血管，肝素抗凝管分离血浆，普通管分离血清；取血后开腹取胰腺组织，胰体迅速制备匀浆，检测胰腺组织中NO含量和iNOS的活性;胰头组织完全浸入4%多聚甲醛,每日更换1次4%多聚甲醛，3 d后用石蜡包埋，用原位缺口末端标记法检测胰腺组织细胞凋亡率。

1.4 血清淀粉酶，胰腺组织N0含量、iNOS活性和腺泡细胞凋亡测定 用普通采血管分离血清，检测血清淀粉酶；检测胰腺组织匀浆中NO含量和iNOS活性，按照NO含量和iNOS活性试剂盒提供的方法进行检测,用TUNEL凋亡细胞试剂盒说明书进行定量检测胰腺腺泡细胞的凋亡。用盲法计数，选取每张TUNEL阳性切片阳性细胞数最多的高倍视野8个，每个高倍视野计数100个细胞和其中的凋亡细胞，凋亡指数=阳性细胞数/800×100%。

2 结果

2.1 手术后观察 取血后开腹观察胰腺，模型组和治疗组有腹水，胰腺局部肿胀变硬，模型组的坏死灶比治疗组多；SO组腹腔内未见腹水和其他异常，胰腺正常。

2.2 血清淀粉酶活性 AP模型组血清淀粉酶显著高于SO组；与AP模型组比较，RPDP治疗后12 h和24 h血清淀粉酶显著降低(P<0.05)；与12 hRPDP治疗组比较，24 hRPDP治疗组血清淀粉酶显著降低(P<0.05)，见表1。

2.3 胰腺组织NO含量和iNOS活性 AP模型大鼠胰腺组织NO含量和iNOS活性显著低于SO组；与AP模型组比较，RPDP治疗后12 h和24 h，胰腺组织内NO含量和iNOS活性显著升高(P<0.05)；与12 h RPDP治疗组比较，24 h RPDP治疗组NO含量和iNOS活性显著升高(P<0.05)，见表1。

2.4 细胞凋亡指数 实验结果显示，SO组和模型组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡发生率较低；与模型组比较，RPDP治疗后12 h和24 h胰腺腺泡细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与12 h RPDP治疗组比较，24 h RPDP治疗组胰腺腺泡细胞凋亡率显著升高(P<0.05),见表1。

表1 RPDP对SD大鼠血清中淀粉酶、NO、iNOS和细胞凋亡的影响

注：与SO组比，#P<0.05；与12 h比，△P<0.05

3 讨论

AP较轻时胰腺腺泡细胞凋亡较多，很少有坏死，AP较重时胰腺腺泡细胞坏死较多，很少有细胞凋亡；胰腺腺泡细胞凋亡之后，多种酶原物质从腺泡细胞内释放到腺泡细胞外，致胰腺炎症反应减轻[3-4]。细胞凋亡有可能是机体自我保护的一种现象，胰腺腺泡细胞凋亡，有可能减轻AP的严重程度。Flint RS研究说明，病情严重程度与胰腺腺泡细胞凋亡呈负相关[5]。研究发现,胰腺组织损害越严重，胰腺细胞凋亡指数就越低，RPDP对胰腺细胞凋亡有诱导作用。

胰腺腺泡细胞NO含量和iNOS活性在AP中有何作用，AP时胰腺腺泡细胞NO含量和iNOS活性显著降低，Werner J认为iNOS活性诱导胰腺腺泡细胞使其NO含量增加，一定含量的NO对AP胰腺微循环有所改善，NO能保护血管内皮细胞，从而对胰腺腺泡细胞起到了保护作用，AP的严重程度减轻了[6],内源性的NO阻断或含量减少有可能加重AP损伤[7-8]。实验说明，经RPDP治疗后胰腺腺泡细胞NO含量和iNOS活性增加，血清淀粉酶降低和诱导胰腺腺泡细胞凋亡指数增加，此实验结果与Thatte U研究一致[9]。RPDP对AP胰腺组织有保护作用是通过增加胰腺组织内NO含量和iNOS活性，协同诱导胰腺腺泡细胞凋亡而实现，但其作用机理还需要大量研究来进一步阐明。

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[5]Flint R S,Phillips A R,Power S E,et al.Acute pancreatitis severity is exacerbated by intestinal ischemia-reperfusion conditioned mesenteric lymph[J].Surgery,2008,143(3):404-413.

[6]Werner J,Fernndez-del Castillo C,Rivera J A,et al.On the protective mechanisms of nitric oxide in acute pancreatitis[J].Gut,1998,43(3):401-407.

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