鹿角胶在大鼠离体肠的吸收研究

律广富,李 娜,林 ,曲晓波,杨 擎,王建玮,林 贺

(长春中医药大学，长春 130117)

鹿角胶的主要成分为蛋白质，鹿角胶始载于《神农本草经》，名为“白胶”，列为上品[1]。鹿角胶的应用有2000多年的历史，中医用之补益气血、滋肾生精；主治肾气不足、阳痿羸瘦、精血虚亏、神倦目昏、腰膝无力、妇女血闭不妊、子宫虚冷、崩漏带下等症[2]。口服是中药及其制剂最常见的临床给药途径之一，而吸收是口服制剂发挥疗效的关键[3]。药物吸收涉及药物通过胃肠道上皮细胞膜的转运进入血液循环，是决定口服药物生物利用度的重要因素。影响药物吸收的原因很多：药物的溶解性，渗透性，化学结构及胃肠道生理因素等[4]，小肠是口服制剂的主要吸收部位，药物肠吸收在某一程度上能反映药物口服后整体的吸收情况[5]。本实验采用氨基酸分析仪检测在不同时间点经离体肠吸收后18种氨基酸的含量，探讨鹿角胶在离体肠内的吸收情况，为进一步研究鹿角胶在体内吸收分布提供依据。鹿角胶中主要成分为蛋白质,其含量在50%以上，中国药典2010年版一部“鹿角胶”项下含量测定方法为定氮法，该方法只能测定样品中总的含氮量，不能准确地反映样品中各种有效成分的真实情况[6]。本实验采用氨基酸分析仪检测18种常见氨基酸的含量，考察经鹿角胶在肠道内的吸收情况。

1 实验材料

1.1 药品 鹿角胶由长春中医药大学研发中心提供。

1.2 标准品 17种混合氨基酸标准品，购自Sigm公司;L-羟脯氨酸(美国Sigma公司，纯度≥99.0%)；苯酚(重蒸)；0.1 mol/L盐酸；实验用水为18.2 MΩ。

1.3 仪器 日立835-50氨基酸分析仪，HW-2000氨基酸分析专用色谱工作站等；SJ-4型pH计(上海雷磁仪器厂)；透皮吸收仪(山东泰盟仪器有限公司)；eppendorf-80 ℃冰箱。

1.4 动物 雄性SD大鼠，体质量180～220 g，清洁级，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号：SCXX-(吉)2010-0005。

2 方法

2.1 氨基酸对照品贮备液的制备 精密称取17种氨基酸混合标准品及L-羟脯氨酸标准品各20 μL至5 mL容量瓶，分别用0.1 mol/L的HCl定容至5 mL，制成标准品溶液。置于-4 ℃冰箱中保存，备用。

2.2 离体肠的制备 取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，小心分离出小肠，剪断(长度约2 cm)，纵向剖开，生理盐水冲洗干净，备用。

2.3 肠离体吸收实验 取离体鼠肠，生理盐水冲洗，将其固定于接收池与扩散池中间，使内层面向供给池，供给池中加入鹿角胶样品(8 mg/mL)释放液，接受池精密加入10 mL生理盐水，排除气泡。有效扩散面积为1.76 cm2。池内循环水温度为37.5 ℃，恒速磁力搅拌100 r/min。加样前将鼠肠内层表面与接收液接触，更换全部接收液，再给药以便降低干扰。加样平衡30 min开始计时，分别于1、2、4、6 h取样，每次取样1mL，同时补充1 mL预温37 ℃生理盐水。

2.4 样品处理[7]称取经肠吸收后的样品1 mL于蛋白水解管中，加6 mol/L盐酸适量，滴入几滴苯酚，充氮后封管，置于110 ℃烘箱中保持24 h，冷却后经滤纸过滤到20 mL容量瓶中，用超纯水反复冲洗水解管及滤纸,最后定容至刻度。取1 mL的样液于蒸发皿中在蒸气浴上蒸干，加超纯水重复3次，残留物用0.02 mol/L HCl定容至10 mL，0.45 μm滤膜过滤，备用上机。

3 结果

3.1 采用氨基酸分析仪检测鹿角胶肠吸收后样品中氨基酸含量,结果见表1,图1～6。

Q为T时间的累积渗透量(μg/cm2)，Cn为第n个取样点的浓度(μg/μL)，A为渗透面积(本实验中仪器释放面积为1.76 cm2),V为接受液的总体积(10 mL)。结果见表2。

表1 鹿角胶肠吸收后样品中氨基酸含量

图1 混合氨基酸标准品

图2 给药前原液中氨基酸含量

图3 肠吸收1 h后含量

图4 肠吸收2 h后含量

图5 肠吸收4 h后含量

图6 肠吸收6 h后含量

氨基酸1 h(ng/20 μL)2 h(ng/20 μL)4 h(ng/20 μL)6 h(ng/20 μL)天冬氨酸(Asp) 185.730237.510261.145270.818苏氨酸(Thr) 104.545125.575224.545294.537丝氨酸(Ser) 151.300172.235180.355236.115谷氨酸(Glu) 357.740440.180453.436511.205甘氨酸(Gly) 727.955914.950993.4051 132.765丙氨酸(Ala) 321.615401.325433.624485.555半胱氨酸(Cys) 136.075144.115145.612208.442缬氨酸(Val) 173.100177.595193.395226.465蛋氨酸(Met) 60.97561.39563.89663.325异亮氨酸(Ile) 54.33564.45186.23594.545亮氨酸(Leu) 146.920169.882178.635189.225酪氨酸(Tyr) 13.93513.98515.36119.945苯丙氨酸(Phe) 675.850574.297936.445996.766赖氨酸(Lys) 236.600260.720274.122300.675组氨酸(His) 53.48061.37569.06877.541精氨酸(Arg) 270.820344.165398.885434.385脯氨酸(Pro) 817.4151 046.9751077.1051161.328L-羟脯氨酸(Hyd) 46.52056.33593.895101.337总渗透量 4 534.9105 267.0556 079.1216 804.952

3.3 鹿角胶肠吸收速率常数 以总氨基酸的累积渗透量(Q)对时间T进行线性回归，所得斜率即为鹿角胶的肠吸收的速率常数J(ng/cm2·h)。结果见图7。

图7 鹿角胶肠吸收速率常数

由图7可知鹿角胶肠吸收的累积渗透回归方程为：y=762.2x+3 766；其吸收速率常数为：762.2 ng/cm2·h。

4 讨论

鹿角胶是用雄鹿已经骨化的鹿角经过水煮熬，去除渣质后浓缩制成固体胶。该品颜色呈现出黄棕或红棕色，胶质半透明，上部分带有黄白色泡沫层。质地硬而脆，容易破碎，劈开断面光洁，透过光照发现不混浊[8]。气无，味微甜。鹿角胶入药已经有2000多年的历史，最早载于《神农本草经》。鹿角胶的作用具有滋肝补肾，增精止血的功效，治疗青年人的虚劳羸弱，中老年人的腰膝酸痛，男子夜梦遗精，女子崩漏带下等都有功效，用药范围针对各种人群极其广泛[9]。近年来研究还发现,鹿角胶有增加白细胞，治疗大脑水肿的作用，特别是用于治疗癌症患者化疗后的后遗症疗效更好。现研究可入丸、散、膏剂[10]。鹿角胶作用广泛，可作为药材与其他类药配伍应用，也可作为补益之品延年益寿，关于鹿角胶的研究已成为现代研究的热点。

本实验采用氨基酸分析仪定时测定鹿角胶经肠吸收后接受液中各种氨基酸的含量，并计算其总氨基酸的累积渗透量、扩散速率等参数，结果显示,鹿角胶经肠吸收后4个时间点的接收液中18种常见氨基酸全部检出，且6 h的总氨基酸的吸收率达到5.3%。其吸收速率为762.2 ng/cm2·h。结果表明，鹿角胶在离体肠内有很好的透过性能，在体内能够迅速的被吸收利用。

鹿角胶不仅是名贵的中药材，而且还是补益佳品，其作用广泛，可与其他药材配伍使用，也可单味入药。本文在鹿角胶药理药效研究的基础上，对鹿角胶的吸收情况做一探讨，结果表明，鹿角胶在离体肠内有很好的透过性能，在体内能够迅速的被吸收利用。为合理的利用和开发鹿产品提供参考。

[1]国家中医药管理局.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,655.

[2]温源凯.熬鹿角胶方法的改进探讨[J].中成药研究,1979(1):34.

[3]Dokoumetzidis A,Kalantzi L,Fotaki N.Predictive models for oral drug absorption:from in silico methods to integrated dynamical models[J].Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology,2007,3(4):491-505.

[4]梁桂贤,刘谦民.药物肠吸收研究方法近况[J].国外医药(合成药·生化药·制剂分册),1998,19(4):251-252,247.

[5]谭晓斌,贾晓斌,陈彦,等.在体肠灌流模型及其在中药研究中的应用[J].中成药,2007,29(11):1665-1668.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2009:225.

[7]陈雄伟,王桂芬.用835-50型氨基酸自动分析仪对羟脯氨酸的测定方法[J].氨基酸杂志,1985(4):5-7.

[8]蒙海燕.鹿茸及鹿角胶主要传统功效作用机理研究[D].长春:长春中医药大学,2008.

[9]翁梁,周秋丽,王丽娟,等.鹿茸多肽促进表皮和成纤维细胞增殖及皮肤创伤愈合[J].药学学报,2001,36(11):817-820.

[10]李娜,曲晓波,姜宗文,等.动物药整理研究——鹿角胶[J].吉林中医药,2014,34(1):74-76.