珍珠母镇静催眠作用及其不同炮制品对小鼠脑内5-羟色胺浓度的影响

刘 冬，代婷婷，查荣博，曲 鹏，李 影,2，杜 鹤，赵思远，宋 利，张 辉*，孙佳明*

(1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118)

珍珠母(Margaritiferaconcha)是常用中药材，为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii(Dunker)的贝壳，具有平肝，潜阳，定惊，止血的功效，用于治疗头眩、耳鸣、心悸失眠等症[1]。主要的成分为CaCO3，含量在90%以上，有机质含量3.5%左右，另含少量的镁、铁离子、氨基酸。为探查珍珠母不同炮制品的镇静催眠作用及作用机制，本实验通过观察不同炮制品对氯苯丙氨酸造模小鼠脑内5-HT浓度的影响,为进一步研究珍珠母的炮制机理提供了具体的科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 雄性健康实验级小鼠60只，体质量(20±2) g。由长春中医药大学实验动物部提供。

1.2 药物 珍珠母烘烤品和超微粉为本实验室自制。

1.3 试剂与仪器 对氯苯丙氨酸(PCPA)，购自Sigma公司；安定注射液，5-HT酶联反应(ELISA)试剂盒购于南京建成生物工程有限公司。酶标仪(日本TARAKA公司)；CO2培养箱，METTLER TOLEDO电子天平(SARTORIUS AG)；CR20B2型冷冻高速离心机(日本日立)；GVDV300三频恒温超声波清洗器(江苏昆山超美)。

2 实验方法

2.1 小鼠自主活动次数的测定 将60只雄性小鼠随机分6组，每组10只,空白组、模型组、阳性组、珍珠母生品组、烘烤品组和超微粉组。模型组按小鼠30 mg/100 g体质量用量腹腔注射PCPA[2]，空白组腹腔注射相同体积的生理盐水。腹腔注射30 h后，小鼠出现昼夜节律消失，模型成功[3]。样品按生药量218.75 g/kg体质量给药，空白组和模型组给同体积生理盐水，阳性组为安定剂量按0.04 mg/20 g。1次/d，连续给药7 d。

2.2 珍珠母不同炮品对小鼠自主活动的影响 给药1周后，禁食12 h，将小鼠放入自主活动仪中适应环境2 min后开始观察并记录5 min内小鼠的活动次数。将各组小鼠给药前后活动次数及差值与空白对照组比较，作t检验统计处理，并用SAS统计软件对实验结果进行单因子方差分析，比较各给药剂量的镇静活性，并记录脑及脑干重量[4]。

2.3 小鼠脑干内5-HT浓度的测定

2.3.1 样品的采集与处理 末次给药12 h后，记录完小鼠自主活动，将小鼠眼球取血,低温2 000～3 000 r/min离心20 min，取上清，暂保存在-80 ℃冰箱，待测。同时在冰盘上取出脑及脑干并称重。

2.3.2 5-HT标准曲线的建立 配制标准品溶液，并用小鼠5-HT试剂盒进行浓度检测,以标准品的浓度及其对应的OD值计算出标准曲线的回归方程：Y=0.003 1X+0.056 2(R2=0.999 2)表明5-HT在62.5～1 000 nmol/L范围内线性关系良好，最低定量浓度为62.5 nmol/L。

2.3.3 小鼠脑内5-HT浓度的测定 根据试剂盒的说明书进行操作,用纯化的5-HT抗体包被微孔板，向各微孔中依次加入样品或标准品、链霉素-HRP、抗5-HT抗体，然后加入洗涤液用洗板机经过彻底洗涤后加入显色剂放入CO2培养箱37 ℃避光显色10 min，然后加入终止液终止反应。用酶标仪在波长为450 nm波长下测定吸光光度值，根据标准曲线方程，计算各样品的浓度。

3 实验结果

3.1 小鼠自主活动及脑系数的比较 由表1可知,小鼠的自主活动模型组较其他组活动的次数平均次数多，其中阳性对照组、超微粉组、与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，烘烤组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。因此超微粉组、烘烤组对PCPA睡眠模型小鼠有助催眠作用,但生品组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。由表可以看出在给药组中超微粉组小鼠平均活动次数最低，提示超微粉比其他给药组镇静催眠作用强。通过对PCPA睡眠模型小鼠脑及脑干系数比较可知，药物对小鼠脑干重量系数基本没有影响(P>0.05)，但通过观察脑系数可知模型组与空白组比较差异有统计学意义,提示PCPA药物改变了小鼠脑重量系数。同时超微粉组、阳性组与模型组比较差异有统计学意义，提示药物可能对PCPA睡眠模型小鼠脑重量系数有影响，这有可能是药物改变了PCPA睡眠模型小鼠除脑干外的其他脑组织生理指标。

表1 各组小鼠的自发活动的比较

注：与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 珍珠母不同炮制品对小鼠脑内5-HT浓度的影响 由表2可知，珍珠母生品组、烘烤品组、超微粉组都可以增加小鼠脑干中的5-HT含量，有助催眠作用。与模型组对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠脑干中5-HT浓度比较 ng/h

注：与模型组比较，#P<0.05。

4 讨论

众所周知，伴随着越来越快的生活节奏，各种各样的社会生存压力不断增加从而导致了更多的人在睡觉时出现障碍，越来越多的人出现了睡眠障碍，尤其是失眠。因而越来越多的研究者为了更好地控制睡眠、缓解失眠而致力于睡眠研究。有研究表明睡眠与大脑内许多神经递质相关，5-HT作为脑内一种重要的神经递质，其参与了睡眠的发生和维持。脑内5-HT能神经元的细胞体主要位于中缝核，Mansari等[5]发现分别破坏中缝核头部和尾部的5-HT能神经元,结果是不同的，前者引起快眼睡眠的减少，后者引起慢眼睡眠的减少，并进而认为中缝核头部的5-HT能神经元与快眼睡眠的产生和维持有关[6]。PCPA是小鼠脑内5-HT合成酶——色氨酸羟化酶的抑制剂,能够阻断脑内5-HT的合成，使5-HT浓度降低，是导致小鼠睡眠时间缩短的主要原因[7]。珍珠母有效组分对睡眠的影响同样和脑内5-HT合成酶抑制剂PCPA相关。本实验研究表明，珍珠母有效组分使5-HT浓度增加[8]。

珍珠母的传统炮制方法为将贝壳用碱水煮过，漂净，刮去外层黑皮，煅至松脆即成。珍珠母作为中医临床的常用中药，具有平肝潜阳，定惊明目的功效，用于头痛眩晕，烦躁失眠，肝热目赤，肝虚目昏，在临床上得到了广泛的应用。本研究表明，珍珠母具有一定的镇静催眠作用，而珍珠母的生品，烘烤品和超微粉均可增加小鼠脑内5-HT浓度,可能是其镇静催眠作用的机制之一。而且从小鼠自主活动、脑系数及脑内5-HT浓度比较分析结果中可以看出超微粉镇静安眠功效最大，而烘烤品、生品的依次降低。

依据肽键热振荡理论，大分子蛋白质等成分经烘烤后，通过分子中肽键热振荡作用，发生物理结构的变化，导致了活性发生相应的改变。其中烘烤品的功效优于生品，说明珍珠母烘烤品在炮制加热过程中，组织疏松，有效成分易于溶出，但某些大分子蛋白或肽类成分易受到破坏，导致活性提高不大；而超微粉品未受到热炮制产生大分子类成分的破坏，仅是物理变化促使蛋白质等有效成分的溶出，故而活性最强。以上结果提示超微粉碎可以作为贝壳类药材的传统热炮制方法的补充和改进。

[1]国家药典委员会.中国药典：一部[M].北京:化学工业出版社,2010.

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[4]戴俊,段金廒,李友宾,等.苏州产淡水珍珠生物活性评价及镇静活性物质基础研究[J].中国生化药物杂志,2008,29(5):294-298.

[5]Mansari M,Sakai K,Jouve t M.Un itary ch aracteristics of presum ptive cholinergic tegm en tal neurons during the sleep-wak ing cycle offreely m oving cats[ J].Exp Brain Res,1989,76(3):519-529.

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[8]刘蓓蓓,张蕴琨.运动与脑组织中5-羟色胺及其代谢物的研究现状[J].南京体育学院学报:自科版,2005,4(4):29-33.