HPLC法测定齐多夫定及其注射液的含量及有关物质*

华 莲，郝桂明，唐素芳

(天津市药品检验所，天津 300070)

药品质量与检验

HPLC法测定齐多夫定及其注射液的含量及有关物质*

华 莲，郝桂明，唐素芳

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立HPLC梯度洗脱法测定齐多夫定及其注射液的含量及有关物质。方法：采用岛津Shim-pack CLC-ODS色谱柱(150 mm×6.0 mm，5 μm)，流动相A为甲醇，流动相B为水，按照时间程序进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为215 nm，柱温为40 ℃。结果：杂质A和杂质C在0.2～50.0 μg/ml浓度范围内均与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9),杂质A平均回收率为99.3%，RSD为1.4%(n=9)；杂质C平均回收率为98.2%，RSD为1.9%(n=9)；杂质B在0.4～50.0 μg/ml浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率为95.8%，RSD为1.0%(n=9)；杂质D在0.2～25.0 μg/ml浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 8),平均回收率为106.8%，RSD为0.8%(n=9)；齐多夫定在0.4～50.0 μg/ml浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)。结论：该方法在一个色谱系统中同时检出杂质A、B、C、D，重复性好，结果准确，可用于齐多夫定及其注射液的含量及有关物质测定。

齐多夫定，注射液，杂质，质量控制，标准提高，高效液相色谱法

齐多夫定最先于1964年合成，由英国GLaxo WeLLcome公司开发上市(商品名为“立妥威”)，1987年3月19日获得美国FDA批准，是世界上第一个获得美国FDA批准生产的抗艾滋病药品，因其疗效确切，成为“鸡尾酒”疗法最基本的组合成分。目前已有近百个国家用于临床，仍是许多发展中国家治疗艾滋病的首选药之一。

齐多夫定的国内合成路线大致相同，以β-胸苷或2,3’-脱水-5’-O-(三苯甲基)胸苷为起始原料，经取代反应、氧桥反应、叠氮化反应、脱保护反应，粗品精制等步骤制备。原料药中潜在的有机杂质主要有杂质A(司他夫定)、杂质B(3’-氯-3’-脱氧胸苷)、杂质C(胸腺嘧啶)、杂质D(三苯基甲醇)、其他副产物等。目前，除《国家食品药品监督管理局标准》(YBH08572008、YBH21522004、YBH04342010)外，齐多夫定在《美国药典》35版、《英国药典》2012版、《国际药典》2011版和《日本药局方》第十六改正版均有收载。国内外各标准大多采用TLC与HPLC两个方法控制齐多夫定的杂质。本文采用HPLC法进行梯度洗脱同时检查齐多夫定及注射液中的所有杂质。

1 仪器与试药

AgiLent TechnoLogies 1260 Infinity高效液相色谱仪，AgiLent TechnoLogies 1290 Infinity紫外检测器。杂质A(司他夫定)对照品(USP REFERENCE STANDARD，USP ROCKVILLE提供，批号FOE050，含量为99.7%)；杂质B(3’-氯-3’-脱氧胸苷)对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号101224-201101，含量为98.0%)；杂质C(胸腺嘧啶)对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号140708-200401)；杂质D(三苯甲醇)对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号101225-201101，含量为99.7%)；齐多夫定对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号100672-200401)；甲醇为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；水为纯化水；齐多夫定3批(1#～3#，批号AT00N120801、AT00N120802、AT00N120803，A公司提供)；齐多夫定注射液3批(4#～6#，批号20120201、20120202、20120203，B公司提供)。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验 采用岛津Shim-pack CLC-ODS (150 mm× 6.0 mm，5 μm) 色谱柱；流动相A:甲醇；流动相B：水，梯度洗脱程序见表1，流速1.0 ml/min；检测波长为215 nm；柱温为40 ℃；进样量10 μl。齐多夫定色谱峰的保留时间约为15 min，齐多夫定峰与杂质B峰的分离度为3.4，能达到完全分离。

表1 齐多夫定梯度洗脱系统

2.2溶液制备

2.2.1含量测定供试品溶液 取1#供试品约10 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2含量测定对照品溶液 取齐多夫定对照品适量，同法操作。

2.2.3有关物质供试品溶液 取1#供试品约10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(齐多夫定注射液精密量取适量同法制备)。

2.2.4有关物质对照品溶液 精密称取杂质A、杂质D对照品12.5 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液①；精密称取杂质B、杂质C对照品各10 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液②；分别精密量取杂质对照品溶液①、②各1 ml，置100 ml量瓶中，精密加入供试品溶液1 ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.3专属性试验 取齐多夫定约10 mg共5份，分别置10 ml量瓶中，加甲醇适量振摇使溶解，在①、②、③3个量瓶中分别加1 mol/L的盐酸溶液2 ml，1 mol/L的氢氧化钠溶液2 ml，30%过氧化氢溶液2 ml，置 60 ℃水浴加热1 h，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏、碱破坏和氧化破坏溶液；将④量瓶置100 ℃水浴中放置3 h，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏溶液；将⑤量瓶加甲醇稀释至刻度，摇匀，置日光下照射72 h后，作为光照破坏溶液。分别取上述溶液，按色谱条件进样，记录色谱图，见图1。

试验表明，齐多夫定在酸、碱、高温条件下杂质均有所增加，在氧化条件下出现一明显未知杂质峰，在光照条件下，杂质C增加较明显。在该色谱条件下，齐多夫定峰与杂质B峰的分离度达到3.4，表明该方法的专属性良好，能使供试品中的杂质完全分离并且定量检出。

2.4线性关系考查 精密称取齐多夫定对照品及杂质A、杂质B、杂质C和杂质D对照品各10 mg，置同一200 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取适量，加甲醇稀释制成浓度为0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/ml的系列溶液，分别精密量取上述溶液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图；以浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。齐多夫定与各杂质的浓度范围与线性方程见表2。

表2 齐多夫定与各杂质的线性范围与回归方程

2.5精密度试验 精密吸取“2.2.4”项下对照溶液10 μl，按上述色谱条件连续进样6次，测定各峰面积。结果杂质A、B、C、D及齐多夫定峰面积的RSD分别为0.42%、0.41%、0.35%、1.0%和0.42%。

1.杂质C 2.杂质A 3.齐多夫定 4.杂质B 5.杂质D

2.6溶液稳定性试验 将“2.2.3” 项下的供试品溶液分别在室温放置4、8、12、24和48 h后依法进样10 μl测定，观察主峰及各杂质峰面积的变化，主峰面积RSD为1.5%。试验结果表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.7重复性试验 取1#供试品6份，按“2.9.2”项下方法重复测定，杂质A的RSD为0(均为0.05%)，杂质B的RSD为0(均未检出)，杂质C的RSD为6.8%，杂质D的RSD为9.5%，杂质总量的RSD为7.6%。

2.8回收率试验 精密称取1#供试品0.5 g置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备液；精密称取杂质A、D对照品各10 mg，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液①，精密称取杂质B、C对照品各10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液②。精密量取供试品贮备液5 ml置50 ml量瓶中(共9份)，分别精密加入杂质对照品贮备液①、②各4、5和6 ml(各3份)，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。杂质A、B、C、D的平均回收率，结果见表3。

表3 平均回收率测定结果(n=9)

2.9供试品的测定

2.9.1含量测定 精密量取“2.2”项下供试品溶液与对照溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，即得。按上述方法对6批样品进行含量测定，结果见表4。

表4 含量测定结果

2.9.2有关物质 精密量取“2.2.4”项下对照溶液稀释25倍，按上述色谱条件测定，齐多夫定色谱峰信噪比为10，作为灵敏度测试溶液(0.04%)。再精密量取“2.2”项下供试品溶液与对照溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2.5倍。按上述方法测定6批样品，同时按现行标准有关物质项下方法测定，结果见表5。

表5 有关物质测定结果

注：-未检出， * TLC法(无法定量)

3 讨论

3.1检测波长的选择 按对照溶液的浓度分别制备杂质A、B、C、D及齐多夫定溶液，在190～400 nm波长范围内测定最大吸收波长。杂质A、B、C及齐多夫定均在266 nm波长处有最大吸收，但是杂质D在该波长处吸收极小，在194 nm处有最大吸收，在低波长处响应值较大(215 nm处为0.3以上)。杂质A、B、C及齐多夫定在215 nm波长处的吸光度与266 nm处无明显差别，同时考虑到流动相组分中有甲醇，故选择215 nm为本系统的检测波长。

3.2检测结果的比较 目前国内外各标准均采用TLC与HPLC两个方法控制齐多夫定的杂质。在TLC法中，杂质B与齐多夫定Rf值相同，不能检出杂质B，主要检查杂质A与杂质D，无法对杂质进行准确定量，对其他杂质也无法准确定量；采用HPLC法检查杂质B、杂质C。而用本法测定，在一个色谱系统中将所有杂质全部检出及准确定量，能更准确地控制产品质量。

HPLCdeterminationofcontentandrelatedsubstancesinzidovudineandinjection

Hua Lian,Hao Guiming,Tang Sufang

(Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070)

Objective： To establish a HPLC gradient elutioned method for evaluating the content and the related substances of zidovudine and injection. Methods： Used Shim-pack CLC-ODS column (150 mm×4.6 mm，5 μm) ,and the mobile phaseA was methanol, mobile phaseB was water, gradient elutioned，the flow rate was 1.0 ml/min with column temperature at 40 ℃.The detection wavelength was 215 nm. Results：The assay displayed a good linearity of impurity A and C over the concentration range of 0.2～50.0 μg/ml(r=0.999 9)，the average recoveries were 99.3%(RSD was 1.4%,n=9)and 98.2%(RSD was 1.9% ,n=9).A good linearity of impurity B over the concentration range of 0.4～50.0 μg/ml(r=0.999 9)，the average recoveries were 95.8% (RSD was 1.0%,n=9).A good linearity of impurity D over the concentration range of 0.2～25.0 μg/ml(r=0.999 8)，the average recoveries was 106.8%(RSD was 0.8%,n=9).A good linearity of zidovudine over the concentration range of 0.4～50.0 μg/ml(r=0.999 9).Conclusion： The method is simple, accurate and can be used to the determination of the content and impurity A、B、C and D in the same chromatographic system.

zidovudine, injection,impurity，quality control,standard improvement,HPLC

2014-03-04

2012年全球基金项目国家药品标准提高品种(No.GF2012-08/09)

R927.2

A

1006-5687(2014)04-0001-04