下丘脑室旁核小电导钙激活钾通道过表达降低慢性心衰大鼠肾交感神经兴奋性*

李晓燕， 刘金玲， 桂 乐， 朱健华

(南通大学附属医院心血管内科，江苏 南通 226001)

慢性充血性心力衰竭(简称慢性心衰,chronic heart failure,CHF)是多数心血管疾病的终末阶段。多年来研究证实交感神经活动增强是慢性心衰发生发展的重要机制，过度的交感神经兴奋性增强对心脏本身和心功能均产生不利影响，这是慢性心力衰竭心功能恶化的主要原因。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是神经内分泌活动的重要调节中枢，是调节细胞外液容量和交感神经驱动的关键脑区。大量研究发现存在于脑组织、外周神经系统和心肌细胞中，具有高度的钾离子选择性、钙离子高度敏感性和电压不依赖性的下丘脑室旁核小电导钙激活钾通道(small-conductance calcium-activated potassium channels,SK通道)可引起神经元的后超极化，对神经的兴奋节律和兴奋模式起重要调控作用。体外实验[1-2]证明阻断PVN内SK通道，PVN头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla, RVLM)神经兴奋性明显增加，还可调节细胞膜的兴奋性。在体实验[3]证明在正常大鼠中阻断下丘脑室旁核SK通道后，肾交感神经兴奋性增强以及平均动脉压升高。目前在心衰发病过程中SK通道对PVN神经元兴奋性调节尚不清楚，我们推测在心衰发展过程中，PVN-RVLM神经元中SK通道功能降低，可能增加神经元的兴奋性，进而促进交感神经的兴奋性增加。为了进一步观察SK通道在心衰中的作用，本研究制作大鼠慢性心力衰竭模型，构建SK2基因过表达载体作用于下丘脑室旁核，观察SK2的表达，记录大鼠心率、血压和肾交感神经活性(renal sympathetic nerve activity,RSNA)的变化，探讨心衰中SK通道与肾交感神经活性的关系，研究慢性心衰的中枢调控机制。

材 料 和 方 法

1 材料与动物

SK2 基因过表达的腺病毒载体rKCNN2重组腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-rKCNN2(AD-rKCNN2, 1×1013pfu/L)和空白对照重组腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP(AD-EGFP, 1×1013pfu/L)由百恩维生物公司提供。兔抗SK2Ⅰ抗购自Alomone Lab；羊抗兔Ⅱ抗购自Santa Cruz。RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit)购自Qiagen。

8～12周龄、 体重(200±20) g的健康雄性SD大鼠由南通大学实验动物中心提供。80只大鼠随机分为4组：假手术对照组(sham-EGFP)、假手术SK2过表达组(sham-rKCNN2)、心衰对照组(CHF-EGFP)和心衰SK2过表达组(CHF-rKCNN2)。以结扎大鼠左冠状动脉前降支制造心衰大鼠模型[4]，假手术组同样开胸打开心包, 但仅在相同部位穿线并不结扎, 术后肌肉注射2×105U青霉素钠预防感染, 术后喂养6周后超声心动图检测心功能变化，采用EF值<42%作为评定心力衰竭的诊断标准[5]。

2 主要方法

2.1下丘脑室旁核腺病毒注射 术后6周4组大鼠均以10%水合氯醛1.5 mL/kg腹腔注射来实施麻醉，固定在脑立体定位仪上，沿矢状缝做皮肤切口暴露颅骨，调整前囟和后囟至同一水平。 PVN位置：B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm，B表示为前囟向后，L表示正中线左右旁开，H表示硬脑膜下深度。电钻颅骨钻孔，用微量注射器插入PVN内，左右两侧分别注射100 nL AD-rKCNN2或AD-EGFP(由百恩维生物公司通过光镜观察对神经没有损伤，转染效果良好)。

2.2AD-rKCNN2 病毒载体过表达效果的验证

2.2.1免疫组化染色 病毒注射后7 d，每组实验大鼠随即抽取5只，麻醉大鼠后, 经心脏灌注4%多聚甲醛固定, 取出脑组织经12%～18%蔗糖脱水固定。取固定后脑组织，头尾方向截取视交叉与乳头体之间部分，在冰冻切片机上进行连续冠状切片，切片厚度 15 μm。切片加3% H2O2室温下孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次×5 min，加SK2抗体孵育，PBS冲洗，每张切片加聚合物增强剂(polymer helper)，加抗兔聚合物(poly-HRP anti-mouse/rabbit IgG)，孵育冲洗，加DAB，室温条件下显色冲洗，苏木素复染。脱水，透明，封片。所有切片采用双盲法由2位有经验的病理科医生阅片。随机观察5个高倍镜视野计数阳性细胞数。

2.2.2组织提取 病毒注射后7 d，每组实验大鼠随即抽取10只，大鼠断头，取脑，移至液氮，随后储存在-80 ℃的条件下，留作进一步的实验。实验时迅速从冰箱中取出冰冻的脑，用冰冻切片机切片。切片厚度：300 μm(60 μm×5)。在冰上操作，用穿孔器，根据大鼠脑定位图谱(Watson & Paxinos)，在2 mm厚(距前囟点-0.84 ～-2.8 mm)的双侧脑片的PVN所在区域，打孔，提取PVN至Eppendorf 管中。

2.2.3Western blotting 取100～150 mg下丘脑室旁核组织, 加入1 mL RIPA， 10 μL苯甲基磺酰氟匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，以去除细胞碎片，收取上清液分装后-80 ℃保存备用。BCA法进行蛋白定量后, 取总蛋白50 μg，与5×上样缓冲液混合煮沸5 min，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白。电泳结束后, 蛋白转印到PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭60 min, 加入SK2Ⅰ抗(1∶200)室温振荡孵育2 h，加入HRP标记羊抗兔Ⅱ抗(1∶500)孵育1 h。然后, 经显色、曝光、扫描、Quantity One图像分析软件进行分析。

2.2.4RT-PCR 取100 mg室旁核组织，置于预冷的匀浆器中，加入1 mL Trizol冰上匀浆，将匀浆液室温放置10 min后倒入1.5 mL EP管中12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清，加0.2 mL氯仿，剧烈摇动30 s，室温3 min。12 000×g、4 ℃离心15 min。 吸上层无色水相转移入另一EP管中(约0.5 mL)。加等体积异丙醇，混匀， 室温 20 min，12 000×g、4 ℃离心10 min。弃上清，加75%乙醇1 mL，振荡。12 000×g、4 ℃离心5 min去上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5～10 min，加入30～50 μL DEPC水，充分溶解RNA，紫外分光光度计法测定RNA，将RNA溶液置于-80 ℃保存备用。按照试剂盒进行逆转录提取cDNA。按照常规方法进行RT-PCR实验。SK2上游引物5’-ACCTGCACGAGATGGACTCA-3’，下游引物5’-TTGTGCTCCGGCTTAGACAC-3’片段大小为145 bp。按照94 ℃×3 min，94 ℃×30 s,-60 ℃×30 s,40个循环，72 ℃ 10 min。扩增完毕后取5 μL 产物于2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶) 电泳, 摄像，分析。

2.3血压、心率和肾交感神经活性的测定 病毒注射后7 d，每组实验大鼠随即抽取5只，2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉后, 将大鼠仰卧固定于手术台上, 气管插管, 分离颈外静脉并插管，分离左侧股动脉并插管, 导管接压力换能器, 与桥式放大器相连，PowerLab 8/30 SP系统采集信号，持续监测动脉血压、平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)和心率；然后动物取俯卧位，利用门齿钩、双侧耳棒将大鼠头部固定于脑立体定向仪上，接着动物取右侧卧位, 经腰部纵行切口沿腹膜后路径暴露左侧肾脏、肾动脉和肾神经，分离肾交感神经，浸入温石蜡油中，安放银丝电极，接生物电放大器，PowerLab 8/30 SP系统采集信号。下丘脑室旁核注射SK2受体阻滞剂apamin(12.5 pmol/100 nL)，记录心率、血压和肾交感神经活性。肾交感神经放电对药物的反应以注药前后实测值之差与注药前相比的百分率表示，其中微量注射前取1 min肾交感神经放电的平均值。微量注射后，在达到最大反应后的1 min时间内求RSNA反应的平均值。肾交感神经放电以实测值与噪声值之差表示，噪声值为股静脉注射10%KCl后10 min的RSNA值。实验结束时,室旁核内微量注射2%滂胺天蓝溶液50 nL, 静脉注射10% KCl处死动物剪取头颅,去除颅骨，将脑组织固定于10%甲醛溶液中2 d后切片在显微镜下定位微量注射点位置，定位不准确者不列入统计。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理,数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠心功能评价

左冠脉结扎术后6周，超声检查可见手术组大鼠存在不同程度的心尖区或心前壁变薄，室壁运动减弱，左心内径扩大，射血分数(ejction fraction,EF)下降。表1显示了假手术组与手术组的基础数据：CHF组左心室舒张期内径(left ventricular interior dimention,LVIDd)较sham组明显增高，EF及短轴缩短率(fractional shortening, FS)较sham组明显降低(P<0.01),差异有统计学意义，见表1。这表明慢性心衰引起心室重构和水钠潴留。

表1 冠脉结扎术后6周大鼠心功能测量值的比较

室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d，心衰组左心室舒张期内径、射血分数和短轴缩短率较注射前有好转，但无统计学意义，见表2。

表2 室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d心功能的测定

2 免疫组化检测大鼠下丘脑室旁核SK2表达的变化

定位注射腺病毒后7 d，灌注处死大鼠取组织做冰冻切片行免疫组化，观察大鼠下丘脑室旁核SK2表达变化，发现SK2阳性细胞表现为细胞浆着棕黄色，心衰对照组(CHF-EGFP)的SK2阳性细胞较少且染色浅，明显低于假手术对照组(sham-EGFP)，SK2 过表达组大鼠下丘脑室旁核SK2阳性细胞数量多且染色深，明显多于心衰对照组，见图1。

Figure 1. The expression of SK2 in the PVN (immunohistoche-mical staining,×200). Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

3 RT-PCR和Western blotting检测下丘脑室旁核SK2 转染及表达水平

腺病毒定位注射后 7 d，取大鼠下丘脑室旁核组织，利用 RT-PCR和Western blotting检测SK2表达，心衰对照组SK2表达明显低于假手术对照组，SK2过表达组明显多于心衰对照组，见图2。

4 微量注射SK2受体阻滞剂apamin后大鼠血压、心率和肾交感神经活性的比较

表3示SK2阻滞剂apamin注射后，CHF-EGFP组较sham-EGFP组的MAP和RSNA增幅降低(P<0.05)。给予AD-rKCNN2后，CHF-rKCNN2组较CHF-EGFP组MAP和RSNA增幅升高(P<0.05)。Sham-rKCNN2和sham-EGFP组对比RSNA无明显变化。各组大鼠心率无明显变化。

讨 论

本实验主要发现心衰大鼠的SK2表达明显少于假手术对照组，PVN微量注射AD-rKCNN2使心衰大鼠增高的肾交感神经活性明显降低，这个结果显示下丘脑室旁核SK2在调节心衰大鼠肾交感神经活性方面起重要作用。

Figure 2. The mRNA (A)and protein (B) expression of neuronal SK2 in the punched paraventricular nucleus (PVN) tissues measured by RT-PCR and Western blotting. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

表3 微量注射SK2受体阻滞剂apamin后大鼠平均动脉压、心率和肾交感神经活性改变的比较

*P<0.05vsCHF-EGFP;#P<0.05vssham-EGFP.

目前认为SK通道至少有3种亚型: SK1(KCNN1)、SK2(KCNN2)和SK3(KCNN3)。在不同的组织细胞上各亚型表达存在差异，在神经系统中主要为SK2和SK3亚型通道。SK的3个亚型对蜂毒明肽(apamin)的敏感性不同，其中SK1不能被apamin阻断，而SK2能被apamin阻断[6]。我们制作大鼠SK2过表达基因(AD-rKCNN2)用于本实验。

交感神经过度激活是心力衰竭的主要病理特征，也是心力衰竭发病率和病死率不断提高的主要原因，PVN是神经活动的重要调节中枢，是调节交感神经驱动的关键脑区，可以通过改变外周交感神经的传出活动发挥它对心血管功能的调节作用[7-9]。神经元兴奋性的重要决定因素是动作电位后的后超极化，它影响神经元的放电功能。SK通道通过介导神经元细胞动作电位的后超极化过程，调控神经元的放电模式[2, 10]。我们的实验通过RT-PCR 和 Western blotting得出心衰大鼠SK2 mRNA和蛋白表达较假手术组明显降低(P<0.05)，给予AD-rKCNN2后，SK2过表达组明显高于心衰对照组且差异有统计学意义，反映了SK2表达确实在心衰状态下较假手术组减低。该结果提示心衰时PVN内出现了SK通道蛋白的表达变化，SK通道亚型的表达受到抑制。有研究表明SK2过表达会引起后超极化电流显著增强[11]，转基因小鼠的小脑神经核团SK2下调可能通过使后超极化电流缺失而导致自主性放电及兴奋性的增加[12]。因此我们推测SK介导中枢神经元放电特性的调控功能在心衰时也会降低。上述研究证实了SK通道的表达变化可以影响其调控神经元活性的功能。我们的研究表明SK2过表达治疗使心衰大鼠增高的肾交感神经活性明显降低，推测其潜在的规律是心衰SK通道表达减少，则PVN神经元自主性放电及兴奋性增加，从而促使交感神经冲动由中枢向外周组织发放增加，并加重心衰的发生。SK通道表达增加，则PVN神经元自主性放电及兴奋性降低，可能改善心衰的进展。

[参 考 文 献]

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