FXR通过调节促甲状腺素胚胎因子减轻Con A诱导的自身免疫性肝炎病变*

连 帆， 王 于， 李家平， 吴锡文， 谢俊聪， 吴泽深， 刘冠琪， 许韩师， 梁柳琴， 杨岫岩， 杨建勇

(中山大学 1附属第一医院风湿免疫科， 2附属第一医院肿瘤介入科， 3中山医学院，广东 广州 510080)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病，病因未明，但严重病例可快速进展为肝硬化和肝衰竭[1-4]。自身免疫性肝炎的可能发病机制是：在遗传易感性基础上，机体免疫耐受机制破坏，产生针对肝脏自身抗原的免疫反应，从而破坏肝细胞导致肝脏炎症坏死。

法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)是激素核受体超家族中的一种胆汁酸受体，主要在肝肠系统等组织器官表达，在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用[5-7]。近年来有研究指出，FXR在自身免疫性疾病中有其独特的抗炎和调节免疫的作用。

促甲状腺素胚胎因子(thyrotropin embryonic factor，TEF)是亮氨酸拉链 (leucine zipper，bZIP) 转录因子家族的成员。最初发现其在胚胎发育时期的腺垂体表达，后发现在小鼠的脑、肺、肾、膀胱和消化道中也表达，而在肝脏中的表达呈昼夜节律性[8-10]。Cavadini等[11]发现肝脏TNF-α表达增加时TEF表达下降，间接提示TEF对于炎症损伤具有保护作用。

本研究旨在观察FXR和TEF在伴刀豆球蛋白A(concanavalin A, Con A)诱导的肝炎(Con A-induced hepatitis, CIH)小鼠肝损害中的作用，探讨FXR-TEF通路改善自身免疫性肝炎的肝功能和减少炎症反应的部分可能机制。

材 料 和 方 法

1 实验分组和动物模型的建立

野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠50只购自上海斯莱克公司。动物饲养恒温于25 ℃环境，自由摄水，12 h交替照明。以Con A(购自Sigma)用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)稀释至浓度2.5g/L，采取尾静脉注射方式，剂量为20 mg/kg，对照组注射等体积PBS。

FXR的激活方法：野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠，随机分为2组，分别为空白处理组和实验组，在注射Con A前分别以普通饲料和1%鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)喂养1周。

2 实验指标检测

2.1小鼠肝功能检测 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h尾静脉取血，离心收集血浆，检测肝酶学指标谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。肝酶检测在全自动生化仪(Hitachi 7600；Tokyo)上完成。

2.2炎症细胞因子测定 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 和24 h取血，离心收集血浆，按照Bio-Plex Suspension Array系统标准流程检测炎症细胞因子干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)和IL-4。多细胞因子检测试剂盒及检测仪器(Bio-Plex 200)均为Bio-Rad产品。严格按标准流程来进行实验并得到结果。板内分析变异系数(coefficient of variation,CV)≤15%，板间分析CV≤25%；标准品及样本回收率为70%～130%；样本中目标检测物线性图的R2值高于0.95，与标准品曲线的斜率差均≤25%。

2.3qRT-PCR 内参照为β-actin，利用Trizol-氯仿-异丙醇法提取总RNA，逆转录合成cDNA，加入上、下游引物和SYBR预混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反应体系在ABI PRISM TM7700 PCR仪进行扩增。引物序列如下：FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTCAA-3’，下游引物5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;TEF上游引物5’-ACCATCTTCCTCTACTGCCATCTTTCAG-3’，下游引物5’-GTACTTGGTCTCGTACTTGGACACGATG-3’；β-actin上游引物5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。

2.4Western blotting检测FXR、TEF蛋白表达的变化 取-80 ℃保存的肝脏组织提取蛋白后，以BCA法测定蛋白浓度，制备上样蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后以5%脱脂奶粉封闭1 h，以0.3% TBST洗膜3次，加入FXR和TEF I抗，4 ℃恒温孵育过夜，再以0.1% TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的II抗，在室温下孵育1 h，洗膜，以ECL化学发光法曝光。内参照为β-actin。

2.5肝脏组织学检测 小鼠肝脏固定脱水，常规石蜡包埋、切片行HE染色。免疫组织化学检测：脱蜡后0.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，微波炉抗原热修复。10%山羊血清封闭。加入FXR和TEF I抗(Santa Cruz)，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，加入II抗，室温孵育，PBS洗3次。DAB显色后，苏木素复染，脱水、中性树胶封片。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 统计软件分析，两组比较采用Student’st-test；多组间比较采用One-way ANOVA，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FXR在Con A诱导的自身免疫性肝炎小鼠中低表达

应用qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学等方法，分别检测正常对照与Con A诱导的自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠肝脏组织中FXR的表达，结果显示FXR在Con A组小鼠中低表达，见图1。

Figure 1. FXR expression detected by qRT-PCR (A，n=8), Western blotting (B，n=9), and IHC (C，n=9) in the liver specimens of control (PBS) mice and CIH mice. Mean±SD.*P<0.05 vs PBS.

2 FXR激活对TEF表达的影响

应用qRT-PCR和Western blotting方法，分别监测喂饲正常食物与喂饲1% CDCA的C57BL/6小鼠肝脏组织中TEF的表达，结果显示喂饲1% CDCA激活FXR 的小鼠，TEF表达上调，显示出FXR对TEF的正调控作用。在Con A所诱导的CIH小鼠，TEF表达降低，CDCA激活FXR后，TEF表达次上调,见图2。

3 FXR激活改善Con A小鼠肝功能

C57BL/6小鼠在注射Con A后分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h取血，离心收集血浆，检测肝酶ALT和AST。结果显示Con A可引起肝损伤，肝酶上升峰值出现在12 h，之后逐渐下降。而注射Con A前喂饲1% CDCA激活FXR的小鼠肝酶上升幅度远低于喂饲普通食物者，显示出FXR激活具有改善肝功能的作用,见图3。

4 FXR激活下调Con A小鼠炎症因子

在注射Con A后分别在0 h、4 h、8 h、2 h、6 h和24 h取血，离心收集血浆，检测炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4和IL-2。结果显示Con A引起炎症因子分泌增加，注射Con A前喂饲1% CDCA激活FXR的小鼠炎症因子上升幅度远小于喂饲普通食物者，显示出FXR激活能减少小鼠肝脏炎症反应,见图4。

讨 论

法尼酯衍生物X受体是胆汁酸受体的一种，主要在肝肠系统等组织器官表达，属于激素核受体超家族的一员，在胆汁酸及胆固醇代谢中发挥重要作用。但FXR的作用远不止于代谢调节。近期研究发现，FXR还具有抗炎和免疫调节的作用。我们之前的研究也表明，FXR具有减轻SLE肝脏炎症损伤的作用[12]。

本研究探讨了FXR在自身免疫性肝炎中的作用，并对其可能的调控通路进行分析。Con A诱导的肝炎是最接近人类自身免疫性肝炎的动物模型，Con A能迅速诱导肝脏炎症发生，表现出肝酶升高、T淋巴细胞浸润、炎症介质如TNF-α及IFN-γ等均明显升高。

本研究结果表明FXR在CIH的表达量较正常C57BL/6小鼠明显下降。这说明FXR在自身免疫性肝炎的发生发展中可能是一个保护性因素。由图3可见，FXR激活能明显降低Con A引起的肝酶升高，显示其对CIH的保护作用。

在CIH中，多种免疫细胞参与炎症反应，如NK细胞、Kupffer细胞和CD4+T淋巴细胞等，有多种炎症介质介导引起肝损害，有研究表明，在自身免疫性肝炎小鼠模型的肝脏和脾脏，TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ表达升高[13-14]。

Figure 2. Effects of FXR activation on the expression of TEF at mRNA (A, C) and protein (B, D) levels in the liver specimens of the C57BL/6 mice with different treatments. A, B: control (PBS) mice with or without 1% CDCA; C, D: CIH (Con A) mice with or without 1% CDCA. Mean±SD. n=9 in A and C; n=10 in B; n=11 in D. *P<0.05 vs PBS; #P<0.05 vs Con A.

Figure 3. Activation of FXR decreased serum levels of ALT (A) and AST (B).Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs Con A+CDCA.

Figure 4. Activation of FXR suppressed the inflammatory cytokines in Con A -induced hepatitis (CIH)mice. Serum IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-2 were measured in the CIH mice and the control (PBS) mice in the presence or absence of CDCA at different time points.Mean±SD n=5. *P<0.05 vs PBS or PBS+CDCA; #P<0.05 vs Con A.

本研究中CIH小鼠体内实验初步证实，FXR激活可减少炎症介质的产生。C57BL/6小鼠被喂养1%CDCA 1周后，FXR可被激活，再注射Con A诱导自身免疫性肝炎，炎症因子检测结果显示PBS饲养和CDCA饲养的C57BL/6小鼠中炎症因子表达不明显；而由Con A诱导的CIH则出现明显增高的炎症因子表达，喂养FXR激活剂CDCA的CIH小鼠炎症因子明显降低，但仍比非CIH小鼠要高(图4)。由此，我们推测，FXR激活能够缓解CIH炎症介质介导的肝脏损伤。

为进一步深入探讨FXR的作用机制，FXR及其靶基因在调节中可能存在某些联系，它们可能具有某种相互作用，在自身免疫性肝炎的发病机制中共同起作用。TEF是亮氨酸拉链转录因子家族的成员。本研究中发现FXR激活明显促进了TEF的表达。FXR被CDCA激活后，TEF mRNA水平与FXR呈正相关，其蛋白表达也有相应的上调。既往研究也发现FXR具有抑制细胞凋亡的作用[12]，而TEF早已被证实为调控凋亡的重要转录因子之一[15]，由此可见FXR-TEF可能通过抑制CIH肝脏细胞过度炎症凋亡而起保护作用。

综上所述，本研究提示，FXR在CIH中具有保护肝细胞、减少炎症因子分泌的作用，激活FXR可能是抑制自身免疫性肝炎的途径之一，而FXR的保护作用可能是通过TEF来实现的。

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