siRNA对预分化骨髓间充质干细胞β2M表达的影响*

戴 兵， 范时洋， 陈 龙， 金海东， 蔡建武， 潘 骏

(温州医科大学附属第二医院骨科, 浙江 温州 325027)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多向分化潜能，特定培养条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、内皮细胞、真皮细胞、神经细胞等中胚层组织[1]，是组织工程理想的种子细胞。鉴于自体细胞临床大范围应用的限制，异体种子细胞的免疫逃逸问题是组织工程发展无法回避的问题之一。MSCs随具有低免疫原性，但植入体内的干细胞可以分化为多种类型的细胞，干细胞的分化是否影响其免疫原性的表达，这是我们要考虑的问题。对影响细胞移植成功的主要障碍是T细胞介导的免疫应答。MHC I分子和CD8+T细胞的相互作用在同种异体或异种移植的排斥反应中起到重要作用[2-3]。BMSCs只表达MHCⅠ，不表达MHCⅡ， MHCⅠ在免疫系统中占有极其重要的地位，广泛表达于一切有核细胞表面，由重链α链和轻链β2-微球蛋白(beta 2-microglobulin, β2M)组成。 β2M是一种低分子量的蛋白质，与重链ɑ链以非共价键连接方式相连，使MHCⅠ在细胞表面能够稳定表达，并能促进抗原肽与MHCⅠ结合[4-6]。RNAi技术是特异性降解与其序列相应的单个内源基因的mRNA[7]。近年来，使用RNAi技术阻断特定基因的表达比反义寡核苷酸等更特异、高效、稳定和低浓度[8-9]。通过RNAi减少或下调MHC I分子蛋白的表达，成功克服了一些限制细胞治疗的免疫反应[10]。我们拟通过RNAi技术使预分化BMSCs的β2M沉默，降低β2M蛋白的表达，为软骨组织工程提供低免疫原性的种子细胞。

材 料 和 方 法

1 动物和材料

健康雄性清洁级4周龄SD大鼠10只，体质量200～240 g，购自温州医科大学实验动物中心，有关动物实验的相关内容通过了温州医科大学伦理委员会的审批。

低糖DMEM和胎牛血清购自Sigma；SD大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导液购自广州赛业；抗生素和抗真菌剂溶液购自Life Technologies；Lipofectamine 2000购自Gibco；FAM-siRNA及转染相关试剂均购自上海吉玛公司;siRNA的序列见表1；β2M 抗体和兔抗羊 IgG-HRP均购自 Santa Cruz；GAPDH antibody购自Bioworld；总RNA快速提取试剂盒购自Generay；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas；qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad。所用引物由上海英潍捷基(Invitrogen)有限公司根据设计合成，见表2。

表1 siRNA序列

表2 引物序列

2 主要方法

2.1骨髓间充质干细胞的分离培养 无菌操作下取4周龄SD大鼠股骨及胫骨干，用一次性注射器吸取无血清DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10% FBS、1%双抗的DMEM培养基吹打混匀后移入25 cm2培养瓶内，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养，24 h后除去未贴壁细胞，以后每3～4 d更换培养基，待细胞铺满瓶底80%以上，0.25%胰酶/0.1% EDTA消化细胞，1 000 r/min离心5 min，按1∶3传代培养。

2.2细胞成软骨诱导 取第3代MSCs加入含10% FBS成软骨诱导液(含基本培养基97 mL, 地塞米松10 μL, 抗坏血酸盐300 μL, 胰岛素-转铁蛋白-硒1 mL, 丙酮酸钠盐100 μL, 脯氨酸100 μL, TGF-β31 mL)，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养，3 d更换培养基，诱导21 d，终止诱导。

2.3细胞转染 实验所需β2MsiRNA由上海吉玛公司设计合成，实验分为5组：实验组3组，分为siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3组；对照组2组，分为空白对照组 (negative control,NC)和非特异siRNA组(non-specific siRNA,NS)。取成软骨诱导21 d的MSCs，种植于放置细胞爬片的24孔板中(5×104cells/well)，培养24 h后进行转染。实验组和非特异siRNA组每孔转染体积100 μL(转染方法参照Lipofectamine 2000说明书)，对照组每孔加等体积的无血清opti-MEM I培养基，避光培养。

2.4Western blotting法检测β2M蛋白表达 冷的PBS洗涤细胞2遍，冰上裂解细胞、离心并收集上清后行蛋白定量，采用10% SDS-PAGE凝胶电泳。蛋白分离后经恒流电转移到PVDF膜，使用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭1 h，与β2M抗体4 ℃孵育过夜，次日加入Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL发光液，移入凝胶成像分析仪，化学光敏模式曝光显影。

2.5实时荧光定量PCR 收集各组细胞，总RNA抽提按Trizol试剂说明书操作，分光光度计测量RNA的纯度及浓度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录为cDNA，采用SYBR Green染色法，以各组cDNA为模板，加入缓冲液、引物等进行PCR，各样本重复3次。反应条件如下：95 ℃变性2 min,95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环40次。

2.6激光共聚焦显微镜下观察β2M 取对照组和siRNA-3组细胞用PBS洗2遍，5% BSA 室温封闭1 h，PBS洗3遍。孵育β2M荧光Ⅰ抗, 37 ℃避光1 h, PBS洗2遍。10 μL DiI染色, 室温, 避光15 min, PBS洗2遍，30%甘油封片。

2.7甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖多聚体 转染24 h后，吸去原液， PBS 洗细胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗细胞2遍，加入 1 mL 甲苯胺蓝染液覆盖细胞表面，室温下孵育 30 min，PBS 洗细胞2遍，常规乙醇脱水、透明及30%甘油封片。倒置显微镜下观察细胞，拍照。

2.8Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)免疫荧光 转染12 h后，吸去原液， PBS 洗细胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗细胞2遍，0.2% Triton X-100破膜30 min，PBS 洗细胞2遍；5% BSA固定1 h，PBS洗细胞2遍；以0.1% Triton X-100稀释Col II Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育细胞1 h，PBS洗细胞2遍；以0.1% Triton X-100 稀释FITC荧光Ⅱ抗(1∶500)，37 ℃孵育细胞1 h，PBS洗细胞2遍；以10 μg/L的DAPI标记孵育15 min，标记细胞核，PBS洗细胞2遍；荧光显微镜下观察细胞，拍照。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同siRNA对 β2M mRNA表达的影响

将MSCs成软骨诱导21 d后，进行siRNA干扰。siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各转染组均比对照组细胞的β2M mRNA表达有不同程度降低。siRNA-3组细胞的目的基因表达减少最明显，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，见图1。

2 不同siRNA对 β2M蛋白表达的影响

Western blotting结果表明,siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各转染组均比对照组细胞的β2M蛋白表达有不同程度降低。siRNA-3组细胞目的蛋白含量减少最明显，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，表明用3种siRNA均成功沉默BMSCs的β2M基因表达，siRNA-3的沉默效果最佳，见图2。

Figure 1. The mRNA expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by real-time qPCR analysis.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

Figure 2. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by Western blotting.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

3 激光共聚焦显微镜下观察β2M

成软骨诱导液中培养21 d后，对照组和siRNA-3 转染组细胞的β2M分布均比较均匀， siRNA-3 转染组的BMSCs相比未转染组β2M明显减少，表明β2MsiRNA可有效沉默β2M基因的表达，见图3。

Figure 3. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs observed by laser confocal microscopy.Scale bar = 50 μm.

4 甲苯胺蓝法染色观察

甲苯胺蓝法染色显示：成软骨诱导21 d后，NC组和siRNA-3组的BMSCs蛋白聚糖多聚体染色均呈阳性反应，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

Figure 4. Aggrecan production in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by toluidine blue staining. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

5 Ⅱ型胶原免疫荧光

Ⅱ型胶原免疫荧光显示：成软骨预诱导21 d后，BMSCs呈多角形，细胞形态清晰，NC组预诱导BMSCs细胞的Ⅱ型胶原免疫荧光强度较siRNA-3转染组的细胞略低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

讨 论

在长期移植过程中，考虑到免疫反应，自体细胞是理想的移植供体细胞。其中，BMSCs因其在哺乳动物体中含量丰富，具有显著的优势。BMSCs因其取材方便、体外扩增能力强，具有多向分化潜能、不涉及伦理道德问题等优点，受到广泛关注[11]。然而自体移植前，细胞的分离、扩增往往十分耗时。这种情况下，同种异体BMSCs因其低免疫原性而成为软骨移植较好的种子来源。BMSCs移植应用于临床将是一个漫长的过程，一旦应用于临床，那么对患者来说有很大好处。充足的种子细胞储存，避免了不必要的自体细胞分离扩增，更能满足不适合自体BMSCs移植的老人的需求。近年来越来越多的研究主要集中在同种异体BMSCs的使用上。

Figure 5. Collagen type II in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by immunofluorescence. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

来源于成人的BMSCs已被证明具有免疫调节活性。比如可以抑制T细胞增殖，调节B细胞功能和树突状细胞的成熟[12]。但是移植的异体BMSCs在特定环境分化过程中，免疫原性是否发生变化呢？Huang等[13]发现预分化的骨髓间充质干细胞相比未分化的骨髓间充质干细胞，增加了免疫原性。其他研究小组证实，将异体间充质干细胞移植到幼龄小鼠[14-15]和猪[16]体内会引起免疫反应。这说明植入的同种异体BMSCs虽然具有低免疫原性，但在体内分化过程中，其免疫原性是增加的，使得它们更易受到免疫排斥。

Isakova等[17]发现将MHCⅠ阳性的雄性猕猴的骨髓间充质干细胞移植到雌性幼龄猕猴中枢系统，引起急性移植排斥反应。但是敲除MHCⅠ或MHCⅡ或两者同时敲除的小鼠胚胎神经元，其免疫原性降低，移植到大鼠脑中可长期存活[18-19]，这些证据说明，抑制MHCⅠ的表达对于BMSCs移植的安全性至关重要。MHCⅠ分子存在于所有有核细胞，包括重链α链和轻链β2M，α链和β2M都是MHCⅠ分子折叠、加工所必须的。有研究表明在缺乏β2M的情况下，细胞的表面不能有效表达MHC I分子[20-21]，这为降低细胞免疫原性提供了新的途径。

siRNA具有高效、特异、低毒、周期短、操作简单等特点，作用于哺乳动物细胞蛋白表达上游的mRNA，是传统的基因敲除技术所不能比拟的。本研究针对β2M mRNA序列，设计了3对β2MsiRNA。Lipofectamine 2000因其转染效率高、安全等特点，目前得到了广泛应用。我们使用Lipofectamine 2000作为载体成功将siRNA安全、完整地转入到BMSCs。通过Western blotting、实时定量PCR和激光共聚焦显微镜观察分析发现转染的预分化BMSCs，其β2M的表达明显下降，其中以siRNA-3的抑制效果最佳。

那么β2MsiRNA转染后对预分化的BMSCs是否有影响呢？基于这方面的考虑，我们选取转染24 h的细胞进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫荧光检测蛋白聚糖多聚体及Ⅱ型胶原蛋白的分泌情况，实验组和对照组无明显差别。

我们利用RNAi技术下调β2M对体外预分化为软骨细胞的BMSCs的免疫原性进行了初步研究。但是，在体内特定条件下，在BMSCs分化过程中沉默β2M基因的表达对免疫排斥反应的抑制效果还有待进一步研究。

[参 考 文 献]

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