癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备及应用*

王玉亮 刘 涛 穆 红

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备及应用*

王玉亮 刘 涛 穆 红△

目的制备抗癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）单克隆抗体，并初步应用。方法利用PCR方法，将GPC3基因重组到原核表达载体pET16b中，在大肠杆菌中表达，纯化后的GPC3融合蛋白对Balb/c小鼠脾内包埋免疫，取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合，应用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot法筛选及鉴定分泌特异性抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，间接免疫荧光检测肝癌细胞中GPC3表达。结果成功构建了GPC3原核表达载体，在大肠杆菌中的诱导表达重组GPC3蛋白。应用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备1株稳定分泌抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过Western blot鉴定具有高度的特异性，间接免疫荧光实验显示单克隆抗体能与HepG2细胞内GPC3特异性结合。结论成功制备出特异性抗人GPC3单克隆抗体。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖类；抗体,单克隆；重组融合蛋白质类；杂交瘤；细胞系；癌,肝细胞；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；单克隆抗体

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）属于硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖家族中的一员，其基因位于人染色体Xq26，由8个外显子组成，cDNA全长2 263 bp，编码580个氨基酸[1]。研究显示，GPC3是一个潜在的肝癌诊断及预测肿瘤复发的分子标志物[2]。为此，笔者拟构建GPC3原核表达载体，通过大肠杆菌表达GPC3蛋白，并以此为抗原制备抗人GPC3单克隆抗体，对其进行纯化、鉴定，在此基础上应用该抗体对肝癌细胞系表达GPC3进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞 SPF级雌性Balb/c小鼠，体质量16～22 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK-（军）2007-004，SPF动物饲养室恒温饲养。骨髓瘤细胞Sp2/0、人肝癌细胞株HepG2由本室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 原核表达载体pET16b（Novagen公司，德国），质粒DNA小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司），限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4连接酶（Fermentas公司，以色列），氨苄青霉素钠（华美公司），RPMI-1640培养基和胎牛血清、HAT 、HT（Gibco公司，美国），聚乙二醇4000（默克公司，德国），小鼠IgG及亚类检测试剂盒（Serotec公司，美国）。PCR扩增仪（Eppendorf公司，德国），数字化凝胶成像系统（Alpha Innotech公司，美国），CO2培养箱（Thermo公司，美国），生物荧光显微镜（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter公司，美国），酶标仪（BioTek公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 GPC3表达载体的构建 根据NCBI检索的GPC3基因序列，设计GPC3扩增引物序列，上游5′-ACGGGATCCGCCAAGAACTACACCAATGC-3′（下划线处为BamHⅠ酶切位点），下游 5′-ATTCTCGAGTTACTCCACCACACCTGCCATACA-3′（下划线处为XhoⅠ酶切位点）。产物片段经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到同样酶切后pET16b载体，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top 10 E.coli，重组质粒酶切鉴定并测序。

1.2.2 重组GPC3蛋白诱导表达和纯化 重组质粒pET16b-GPC3转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取单个克隆菌落接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；次日以1∶50的比例接种于相同培养基中，37℃振荡培养至对数中期，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，于室温继续振荡培养。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达，进行亲和层析纯化。纯化后的GPC3蛋白进行蛋白定量，以确定重组蛋白的浓度。

1.2.3 杂交瘤建株及腹水制备 Balb/c小鼠乙醚麻醉后脾脏内置入1块载有重组GPC3抗原的三角形硝酸纤维膜，使之完全包埋于脾脏内。观察无出血后回纳脾脏。间隔3周后，用同样方法再进行1次包埋，于取脾脏融合前3 d，腹腔注射重组GPC3抗原加强免疫。细胞融合具体方法参照文献[3]，经免疫的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合后经HAT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，阳性细胞株经3次有限稀释克隆，选取产生抗体滴度高的杂交瘤细胞，并按常规方法制备单克隆抗体腹水[3]。

1.2.4 单克隆抗体纯化 采用饱和硫酸铵盐析法纯化抗体。

1.2.5 单克隆抗体的类别及亚类鉴定 采用小鼠IgG及亚类检测试剂盒以间接ELISA法检测。

1.2.6 杂交瘤细胞株染色体检查 按常规核型分析方法进行杂交瘤细胞的染色体检查。

1.2.7 单克隆抗体的免疫印迹分析 纯化抗原经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取下凝胶进行电转移，电转移完毕取出硝酸纤维膜，进行常规免疫测定。

1.2.8 间接免疫荧光染色 制备肝癌细胞株HepG2的细胞爬片后，以杂交瘤单克隆抗体的腹水作为一抗4℃过夜，PBS清洗，荧光二抗37℃孵育1 h，PBS清洗后置于荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 GPC3目的基因的酶切鉴定 GPC3目的基因经双酶切后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳显示基因片段长度为500 bp左右，与预期片段大小相符，见图1。酶切鉴定片段大小正确的质粒经Invitrogen公司测序，与GenBank中检索GPC3 cDNA序列（Accession number:NM_001164617）100%同源，无碱基错配和移码突变，见图2。

2.2 重组GPC3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 重组质粒pET16b-GPC3转化大肠杆菌E.coli BL21，IPTG诱导表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观察，含重组质粒的诱导菌在19 ku处出现目的条带，与预期大小基本相符，诱导表达成功，见图3。经过蛋白亲和纯化柱纯化后，可得到纯化的重组GPC3。

Figure 1 The agarose gel electrophoresis of GPC3 DNA by restriction enzyme digestion analysis图1 GPC3基因片段酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图

Figure 3 The induction expression of GPC3 protein图3 GPC3蛋白诱导表达

2.3 抗GPC3杂交瘤细胞的建株 免疫Balb/c小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合后，经3次亚克隆，间接ELISA筛选后，获得1株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

2.4 染色体分析 对杂交瘤细胞株进行染色体分析，染色体数目均值为98，证实得到的细胞株基本上是小鼠脾细胞和Sp2/0细胞染色体数之和。

2.5 杂交瘤细胞分泌抗体类型的检测结果 间接ELISA检测单克隆抗体为IgG1亚型，κ轻链。

2.6 单克隆抗体的免疫印迹分析 免疫印迹显示纯化的单克隆抗体与分子质量为19 ku的重组GPC3抗原分子有特异性反应条带，见图4。

Figure 4 The identification of monoclonal antibody specificity by Western blot assay图4 Western blot鉴定单克隆抗体的特异性

2.7 单克隆抗体间接免疫荧光染色 间接免疫荧光染色显示单克隆抗体2F3与HepG2细胞呈阳性反应，见图5。

Figure 5 The indirect immunofluorescence staining of HepG2 cell line（×400）图5 HepG2细胞间接免疫荧光染色（×400）

3 讨论

肝细胞肝癌（HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一，HCC的发病率位于全球恶性肿瘤发病率的第5位，每年有超过50万的新发病例，近100万人死于该疾病，居肿瘤死亡原因的第3位，我国是HCC高发地区，其死亡率在消化道恶性肿瘤中排第3位，且近年来肝癌的发病率在世界范围内呈上升趋势[4]。通过监测肝癌患者肿瘤标志物，可提早发现肿瘤或肿瘤复发、转移，提高预测和诊断的针对性，有利于完善患者治疗方案，延长患者生存时间。国内外最新研究表明，癌胚抗原GPC3作为一种分子标志物在HCC的诊断、鉴别诊断方面具有重要临床应用价值[2,5]。Ishiguro[6]及 Ho等[7]研究显示抗 GPC3 抗体具有抗肝癌作用。因此，制备针对GPC3的抗体对于肝癌临床诊断和免疫治疗具有重要的临床意义。

本研究利用基因工程的方法，克隆GPC3蛋白部分原核表达载体，GPC3全蛋白大约70 ku，在之前的预实验中，笔者已经用一系列载体尝试过表达GPC3全长或部分序列，根据实验结果并考虑到表达的通畅、表达蛋白的免疫原性以及制备抗体的特异性和有效性，本研究选取了GPC3的中间510 bp序列进行GPC3原核表达载体的构建，使得重组GPC3蛋白在大肠杆菌中诱导表达，纯化后的重组GPC3蛋白经验证，在19 ku处出现一条蛋白带。本研究以重组GPC3蛋白作为抗原，对Balb/c小鼠脾内包埋免疫，获得良好的效果。此法相对其他方法而言具有周期短、免疫原性高、免疫效果好及抗原用量少等优点。笔者通过经典的单克隆抗体杂交瘤细胞融合技术，成功地建立了一株稳定分泌抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，应用获得的抗GPC3单抗进行间接免疫荧光检测，发现该抗体与肝癌细胞中天然结构的GPC3蛋白特异性结合，证明GPC3单克隆抗体不仅能够识别基因工程表达的蛋白，还能特异性识别肝癌细胞表达的GPC3，为进一步应用于肝癌的临床诊断、预测肿瘤复发及个体化治疗奠定了基础。

Figure 2 The sequencing figure of GPC3 gene图2 GPC3基因测序图

[1] Filmus J,Capurro M,Rast J.Glypicans[J].Genome Biol,2008,9(5):224.

[2] Wang YL,Zhu ZJ,Teng DH,et al.Glypican-3 expression and its relationship with recurrence of HCC after liver transplantation[J].World J Gastroenterol,2012,18(19):2408-2414.

[3]李宗波,王玉亮.抗转化生长因子β诱导蛋白单克隆抗体的制备[J].生物医学过程与临床,2012,16(5):486-488.

[4] Yang JD,Harmsen WS,Slettedahl SW,et al.Factors that affect risk for hepatocellular carcinoma and effects of surveillance[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2011,9(7):617-623.

[5] Filmus J,Capurro M.Glypican-3:a marker and a therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].FEBS J,2013,280(10):2471-2476.

[6]Ishiguro T,Sugimoto M,Kinoshita Y,et al.Anti-glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer[J].Cancer Res,2008,68(23):9832-9838.

[7]Ho M,Kim H.Glypican-3:a new target for cancer immunotherapy[J].Eur J Cancer,2011,47(3):333-338.

（2013-09-28收稿 2013-12-03修回）

（本文编辑 李国琪）

Preparation and Preliminary Application of Monoclonal Antibody Against Carcinoembryonic Antigen Glypican-3

WANG Yuliang,LIU Tao，MU Hong
Tianjin First Central Hospital,Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo prepare monoclonal antibody specifically against carcinoembryonic antigen glypican-3(GPC3)and its preliminary application.MethodsGPC3 was cloned with PCR to pET16b vector and expressed in E.coliBL21.Spleen cells were obtained from Balb/c mice embedding immunized with purified antigen intraperitoneally,and fused with Sp2/0 cells.Hybridoma cells were screened by indirect ELISA,and identified by Western blot assay using purified protein after the cell fusion.The indirect immunofluorescence method was used to detect the GPC3 expression in HepG2 cell line.ResultsThe prokaryotic expression vector of GPC3 was successfully constructed,and GPC3 was stably expressed in E.coliBL21.A mouse hybridoma cell line secreting monoclonal antibody to GPC3 was obtained.Western blot analysis showed that monoclonal antibody specifically recognized recombinant protein.Monoclonal antibody could be used to detect GPC3 protein expression in HepG2 cell line by indirect immunofluorescence.ConclusionThe monoclonal antibody against GPC3 was successfully obtained.

glypicans;antibodies,monoclonal;recombinant fusion proteins;hybridomas;cell line;carcinoma,hepatocellular;GPC3;monoclonal antibody

R392.11【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.013

*天津市卫生局重点学科建设-重点实验室建设经费资助项目；国家临床重点专科建设项目资助课题

天津市第一中心医院，卫生部危重病急救医学重点实验室（邮编300192）

△通讯作者 E-mail：tjmuhong@sina.com