荔枝核总黄酮改善胆总管结扎大鼠胆汁淤积症状的研究*

成秋宸 赵永忠△ 肖绪华 刘瑞彪 黄大健 李胜联 徐 庆

荔枝核总黄酮改善胆总管结扎大鼠胆汁淤积症状的研究*

成秋宸1赵永忠1△肖绪华1刘瑞彪2黄大健1李胜联3徐 庆4

目的观察荔枝核总黄酮（TFL）对胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝功能p16蛋白、3型胶原（PC3）和Ⅰ型胶原（PCⅠ）的影响。方法40只大鼠随机分为假手术（SO）组、胆总管结扎（BDL）组、TFL组和水飞蓟宾胶囊（SIL）组。SO组、BDL组生理盐水灌胃5 mL/(kg·d)，TFL组TFL灌胃200 mg/(kg·d)，SIL组SIL灌胃5 mL/(kg·d)，均持续4周。取血清检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、直接胆红素（BILD）、总胆红素（BILT）。取肝组织行HE、Masson染色；Western blot检测p16、PC3、PCⅠ的表达。结果SO组ALT（IU/L：44.6±8.0）、AST（IU/L：103.8±18.1）、BILD（μmol/L：0.76±0.28）、BILT（μmol/L：1.48±0.35）值最低；BDL组ALT（147.4±86.3）高于TFL组（92.9±47.3），AST（362.7±106.6）高于TFL组（290.1±171.7）和SIL组（250.2±54.9），BILD（99.71±40.87）低于SIL组（137.01±38.86）；TFL组BILD（81.48±47.50）、BILT（106.64±61.04）均低于SIL组（均P＜0.05）。TFL组存在少量新生胆管，细胞水肿变性不明显，少量炎细胞浸润及胶原沉积，较BDL组肝纤维化程度明显改善。SIL组肝汇管区新生胆管较TFL组明显，有细胞变性水肿，炎细胞浸润，汇管区有纤维间隔，程度较BDL组轻，汇管区有胶原沉积。BDL组p16、PC3、PCⅠ蛋白表达高于TFL组，PC3蛋白低于SIL组，PCⅠ蛋白高于SIL组（均P＜0.05），p16蛋白与SIL组差异无统计学意义；TFL组PC16、PC3蛋白表达低于SIL组（P＜0.05），PCⅠ蛋白与SIL组差异无统计学意义。结论TFL可改善胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝功能，减轻肝组织纤维化；其机制可能与抑制肝组织p16、PC3、PCⅠ蛋白表达有关。

荔枝核总黄酮；胆汁淤积性肝纤维化;Ⅰ型胶原蛋白;3型胶原蛋白;p16

胆汁淤积性肝病是一组以胆汁淤积为主要原因，以肝脏纤维化为主要表现的疾病，黄疸是其最明显的临床表现。去除病因是其根本的治疗措施，同时应考虑对肝细胞的保护，改善胆汁淤积，减轻和消除黄疸[1]。研究发现荔枝核作为传统中药，在保肝、抗氧化等方面具有较好的疗效[2]。本课题组前期研究显示荔枝核总黄酮（total flavone from litchi chinensis sonn，TFL）对胆汁淤积性肝纤维化大鼠有较好的抗纤维化疗效[3-4]。本研究采用胆总管结扎（bild duct ligation，BDL）制备继发性胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型，观察TFL对大鼠肝功能、p16蛋白、3型胶原（PC3）和Ⅰ型胶原（PCⅠ）的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量150～170 g，购自广西医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK桂2009-0002），由桂林医学院实验动物中心饲养、造模，温度15～20℃，湿度60%～70%，光照随昼夜变化，自由饮食水。采用完全随机法将大鼠分为假手术（sham operation，SO）组、BDL组、TFL组和水飞蓟宾胶囊（silybinin，SIL）组，每组10只。

1.2 药物 原料荔枝核购自桂林市七星公园药材市场，经鉴定为无患子科植物荔枝的成熟种子，由桂林工学院有机化学教研室经漂洗干燥粉碎，乙醇回流提取TFL，经高效液相色谱分析其TFL成分为853 g/kg，用蒸馏水溶解为40 g/L溶液。SIL购自天津天士力集团，每颗胶囊含SIL35 mg。

1.3 主要试剂 超氧化物歧化酶（SOD）测试盒购于南京建成生物工程研究所。肝功能试剂盒，包括血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、直接胆红素（BILD）、总胆红素（BILT），BCA蛋白定量试剂盒均购自北京碧云天生物公司，抗p16单克隆抗体购自BD公司，抗β-actin单克隆抗体购自CST公司，抗PC3多克隆抗体购自Abcam公司，抗PCⅠ（Pro COL1A2）多克隆抗体购自santa cruz公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗山羊、山羊抗小鼠抗体均购自北京中杉金桥生物公司，Western blot蛋白预染marker购自美国NEB公司，化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.4 模型制备与给药 按照文献[5]的方法制备BDL大鼠模型。入实验室适应1周后，BDL、TFL和SIL组大鼠行腹腔注射水合氯醛麻醉，腹部皮肤常规消毒，沿腹正中线切开，游离胆总管并双重结扎后于节间切断，SO组仅分离胆总管后关腹，不结扎不切断胆总管。术后第2天，SO组和BDL组用生理盐水灌胃5 mL/(kg·d)，TFL组用40 g/L的TFL灌胃200 mg/(kg·d)，SIL组用10 g/L的SIL灌胃5 mL/(kg·d)[6]，均持续4周。BDL组大鼠死亡2只，SIL组死亡1只，死亡原因为急性肝衰竭，SO组和TFL组大鼠均无死亡。

1.5 样品采集与处理 术后4周，采用放血法处死大鼠，摘取肝脏测量并称其质量，留取大鼠肝右叶组织，冰生理盐水清洗后，10%中性福尔马林固定72 h后制备石蜡标本，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.6 观察项目与方法 （1）一般情况：大鼠耳部、爪部皮肤黏膜颜色，尾部淤斑，舌色，肝脏形态、质地等。（2）肝指数（肝脏湿质量/体质量×100%）和SOD含量。（3）肝功能：电化学发光法检测ALT、AST、BILD和BILT。（4）肝组织病理学观察：HE、Masson染色，光镜下观察肝组织的病理变化，根据肝纤维结缔组织增生程度将肝纤维化分为0～4期[7]。（5）Western blot检测：每个标本经液氮研磨提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜，BSA封闭，用一抗（p16、PC3和PCⅠ，均为1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，TBST洗涤后加相应HRP二抗室温孵育1 h，洗涤，ECL显影，Kodak Image Station 4000R化学发光成像系统曝光，同一张膜用一抗二抗去除液洗脱后，封闭，加入β-actin抗体稀释液（1∶1 000稀释）孵育，作为内参照。

1.7 统计学方法 采用PEMS 3.1软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行方差齐性检验，方差齐者多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验；方差不齐者采用Kruskal-Wallis秩和检验，组间多重比较采用t检验。等级计数资料多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，组间多重比较采用Nemenyi法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 SO组大鼠毛发光滑，耳廓色粉，爪色淡粉，舌色粉，尾巴无淤斑，肝脏柔软。BDL组大鼠毛发干枯，耳廓色黄，爪色黄，舌色黯红，尾巴大量淤斑，肝脏体积大，质硬，色黄，边缘钝。TFL组大鼠毛发稍干枯，耳廓色浅黄，爪色淡黄，舌色淡红，尾巴稍有淤斑，肝脏体积稍大，质稍硬，色淡黄，边缘稍钝。SIL组大鼠毛发干枯，耳廓色黄，爪色淡黄，舌色红，尾巴有淤斑，肝脏体积增大，质稍硬，色黄，边缘钝。

2.2 各组大鼠血清学指标比较

2.2.1 各组大鼠肝指数和SOD值比较 BDL、TFL和SIL组肝指数均高于SO组（均P＜0.05），但BDL、TFL和SIL这3组间差异无统计学意义。除BDL组SOD值显著低于SO组（P＜0.05）外，其他各组SOD值差异无统计学意义，见表1。

Table 1 Comparison of liver index and SOD value between four groups表1 各组大鼠4周肝指数及SOD值的比较

2.2.2 各组大鼠肝功能的比较 BDL、TFL和SIL组ALT、AST、BILD、BILT水平均高于 SO组（均P＜0.05）；TFL组ALT、AST均低于BDL组（均P＜0.05）；SIL组AST低于BDL组，BILD高于BDL组和TFL组，BILT高于TFL组（均P＜0.05），见表2。

Table 2 Comparison of liver function between four groups表2 各组大鼠血清肝功能水平的比较

2.3 各组大鼠肝组织病理学改变

2.3.1 各组大鼠肝组织HE及Masson染色 SO组肝小叶结构完整，由肝汇管区呈条索状放射状排列，见图1A，无胶原沉积，见图2A。BDL组多数肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，有大量肝细胞变性和嗜酸性粒细胞变性，炎细胞浸润，部分存在脂肪变性，汇管区有大量新生胆管，见图1B，纤维间隔扩大，胶原增多，见图2B。TFL组肝汇管区结构存在，少量新生胆管，细胞水肿变性不明显，少量炎细胞浸润，见图1C，少量胶原沉积，见图2C。SIL组肝汇管区新生胆管较TFL组明显，有细胞变性水肿，炎细胞浸润，汇管区有纤维间隔，程度较BDL组轻，见图1D，汇管区有胶原沉积，见图2D。

2.3.2 各组纤维化程度分期比较 SO组以0期为主，BDL组以3、4期为主，TFL组以1、2、3期为主，SIL组以2、3期为主，其中BDL组、SIL组与SO组比较差异有统计学意义，见表3。

Table 3 Comparison of stagings of liver fibrosis between four groups表3 各组肝纤维化程度分期比较

Figure 4 Comparison of expressions of p16，PC3 and PCⅠproteins in rat liver tissues between four groups图4 各组肝组织p16、PC3、PCⅠ蛋白表达水平比较

2.4 各组肝组织p16、PC3、PCⅠ蛋白表达的比较 见图3、4。BDL、TFL和SIL组p16、PC3、PCⅠ蛋白的表达均高于SO组（均P＜0.05）。TFL组p16、PC3、PCⅠ蛋白的表达均低于BDL组（均P＜0.05）。SIL组p16蛋白的表达与BDL组差异无统计学意义，而高于TFL组（P＜0.05）；SIL组PC3蛋白的表达高于BDL组和TFL组（P＜0.05）；SIL组PCⅠ蛋白的表达低于BDL组（P＜0.05），与TFL组比较差异无统计学意义。

3 讨论

胆汁淤积是胆汁淤积性肝病的主要表现，是发展为肝硬化及进一步发展为肝癌的前奏[2]。罗伟生等[4]研究发现，TFL可使二甲基亚硝胺所致的肝纤维化大鼠血清SOD含量明显升高，进而通过降低机体脂质过氧化反应来减轻肝损伤及肝纤维化程度。本研究结果显示，术后4周，BDL组大鼠毛发干枯，耳廓、爪色黄，舌色黯红，尾部出现淤血斑；TFL组与SIL组大鼠耳廓颜色、舌色、爪色、毛发的光泽度，以及尾巴淤血症状较BDL组有明显改善。TFL组ALT、AST均低于BDL组，BILD、BILT均低于SIL组，且病理结果显示TFL组肝纤维化程度明显改善，提示TFL有较好的保护肝细胞、改善肝功能、降低胆红素和抗肝纤维化的作用。TFL的退黄机制可能是通过转甲基作用，恢复和提高肝细胞膜流动性以及增加Na+/K+-ATP酶泵的活性，从而激活胆汁输送机制，改善肝内胆汁淤积[8]；另外，还可通过转硫基作用，增加谷胱甘肽的合成，进而提高抗氧化和抗自由基能力，从而提供肝细胞的保护作用[9]。但具体机制尚需进一步的实验验证。

凋亡因子和衰老理论是近几年开发中成药治疗肝纤维化的新思路[10]。p16-pRb和p53-p21-pRb是与细胞衰老相关调控的主要途径[11]。Hirsova等[12]报道在肝纤维化硬化过程中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的作用是诱导肝实质细胞凋亡，促进肝纤维化向肝硬化的发展。孙旭锐等[13]研究表明TFL在体外通过诱导凋亡来抑制大鼠肝星状细胞增殖。本课题组前期研究亦发现TFL能抑制胆汁淤积性肝纤维化大鼠TRAIL的表达[5]。PCⅠ是肝纤维化、肝硬化时肝细胞外基质的主要成分，可作为反映胶原代谢的重要参数，是判断肝纤维化的严重程度和抗纤维化治疗的疗效指标之一[14]。本研究结果显示TFL可明显抑制胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏p16、PC3、PCⅠ蛋白的表达，提示其可能与TFL通过诱导细胞凋亡来抑制肝纤维化有关。

SIL作为生物类黄酮，因具有抗氧自由基，抗脂质过氧化[15]，保护肝细胞改善肝功能的作用，而被FDA批准作为抗肝纤维化用药。本研究结果显示TFL组p16、PC3蛋白的表达均低于SIL组，PCⅠ蛋白与SIL组无明显差异,提示用TFL治疗胆汁淤积性肝纤维化大鼠，在护肝、退黄、抗纤维化方面具有独特优势，其可能是通过诱导肝细胞凋亡，促进肝细胞再生，降低汇管区胆管增生等机制来抑制肝纤维化的发展。但TFL是否可作为抗肝纤维化的新型中药制剂应用于临床，尚需进一步深入研究。

Figure 1 HE staining of light microscopy images in four groups(×100)图1 各组大鼠肝脏光镜HE染色图（×100）

Figure 2 Masson staining of light microscopy images in four groups(×100)图2 各组大鼠肝脏光镜Masson染色图（×100）

Figure 3 Comparison of expressions of PC3，p16and PCⅠproteins in rat liver tissues between four groups图3 各组大鼠肝组织PC3、p16、PCⅠ蛋白表达电泳结果

[1] 陆伦根,胡俊杰.肝纤维化研究进展[J].肝脏,2012,17(9):617-620.

[2]Friedman SL.Evolving challenges in hepatic fibrosis[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010,7(8):425-436.

[3]赵永忠,肖绪华,漆志平,等.荔枝核总黄酮对大鼠肝纤维化TGF-β1及CTGF表达的影响[J].河北医药,2010,32(10):1194-1196.

[4] 罗伟生,欧士钰,靳雅玲,等.荔枝核总黄酮抗肝纤维化作用的实验研究[J].重庆医学,2013,42(4):373-378.

[5] 赵永忠,漆志平,徐庆,等.荔枝核总黄酮抗胆管结扎大鼠肝纤维化的作用及机制[J].世界华人消化杂志,2010,18（20）:2084-2089.

[6]Jia JD,Bauer M,Cho JJ,et al.Antifibrotic effect of silymarin in rat secondary biliary fibrosis is mediated by downregulation of procollagen alpha1(I)and TIMP-1[J].J Hepatol,2001,35（3）:392-398.

[7]中华肝脏病学会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识[J].药品评价,2007,4(4):265-266.

[8]Hegazy SK,El-Bedewy M,Yagi A.Antifibrotic effect of aloe vera in viral infection-induced hepatic periportal fibrosis[J].World J Gastroenterol,2012,18(17):2026-2034.

[9]Idrissi ME,Hervieu V,Merle P,et al.Cause-specific telomere factors deregulation in hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2013,32(1):64.

[10]Lavallard VJ,Bonnafous S,Patouraux S，et al.Serum markers of hepatocyte death and apoptosis are non invasive biomarkers of severe fibrosis in patients with alcoholic liver disease[J].PLoS One,2011,6(3):e17599.

[11]孔德松,魏东华,张峰，等.肝纤维化进程中细胞衰老的作用及相关机制的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2012,26(5):688-691.

[12]Hirsova P,Ibrahim SH,Bronk SF,et al.Vismodegib suppresses trailmediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis[J].PLoS One,2013,8(7):e70599.

[13]孙旭锐,覃浩,罗伟生,等.荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用[J].广东医学,2012,33(15):2215-2217.

[14]Hennenberg M,Trebicka J,Kohistani Z,et al.Hepatic and HSC-specific sorafenib effects in rats with established secondary biliary cirrhosis[J].Lab Invest,2011,91(2):241-251.

[15]盛云建,吴刚,陈炘，等.灵芪蠲肝液抗CCl4诱导的肝损伤机制研究[J].天津医药,2012,40(3):258-261.

（2013-08-20收稿 2013-10-20修回）

（本文编辑 陈丽洁）

An Experimental Study of Total Flavone from Litchi Chinensis Sonn Improving Symptoms of Cholestatasis in BDL Rats

CHENG Qiuchen1,ZHAO Yongzhong1,XIAO Xuhua1,LIU Ruibiao2,HUANG Dajian1,LI Shenglian3,XU Qing4
1 Department of Digestive Medicine,The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001,China，2 Department of Laboratory;3 School of Public Health，Guilin Medical University；4 College of Pharmacy，Guilin Medical University

ObjectiveTo observe the effects of total flavone from litchi chinensis sonn(TFL)on the liver function including p16 protein,pro collagen type 3(PC3)and pro collagen typeⅠ(PCⅠ)in model rats with liver fibrosis induced by bile duct ligation.MethodsForty rats were randomly divided into four groups:sham operation(SO)group,bile duct ligation(BDL)group,TFL group and silibinin(SIL)group.Rats were gavaged with saline(5 mL·kg-1·d-1)in SO and BDL group,rats were gavaged with TFL(200 mL·kg-1·d-1)in TFL group and rats were gavaged with SIL(5 mL·kg-1·d-1)in SIL group for four weeks.The serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),bilirubin direct(BILD)and bilirubin total(BILT)were detected in four groups.The liver tissues were stained by HE and Masson methods.The expression levels of p16,PC3 and PCⅠin liver tissues were determined by Western blot assay.ResultsThe serum levels of ALT(44.6 IU/L±8.0 IU/L),AST(103.8 IU/L±18.1 IU/L),BILD(0.76 μmol/L±0.28 μmol/L)and BILT(1.48 μmol/L±0.35 μmol/L)were lower in SO group.There was a higher level of ALT in BDL group(147.4 IU/L±86.3 IU/L)than that of TFL group(92.9 IU/L±47.3 IU/L).The serum level of ALT was higher in AST group(362.7 IU/L±106.6 IU/L)than that of TFL group(290.1 IU/L±171.7 IU/L)and SIL group(250.2 IU/L±54.9 IU/L).The serum level of BILD was lower in BDL group(99.71 μmol/L± 40.87 μmol/L)than that of SIL group(137.01 μmol/L ± 38.86 μmol/L).The serum levels of BILD and BILT were significantly lower in TFL group(81.48 μmol/L±47.50 μmol/L,106.64 μmol/L±61.04 μmol/L)than those of SIL group(P＜0.05).There were small amount of new bile duct and no obvious cells degeneration,small amount of infiltration of inflammatory cells and collagen deposition in TFL group.The liver fibrosis improved significantly in TFL group than that of BDL group.There were more new bile duct in hepatic portal area in SIL group than those of TFL group.The expression levelsof p16,PC3 and PCⅠwere significantly higher in BDL group than those of TFL group.The expression level of PC3 was significantly lower in BDL group than that of SIL group.The expression level of PCⅠwas significantly higher in BDL group than that of SIL group(P＜0.05).There was no significant difference in the expression level of p16 between BDL group and SIL group.The expression levels of PC16 and PC3 were significantly lower in TFL group than those of SIL group(P＜0.05).There was no significant difference in the expression level of PCⅠbetween TFL group and SIL group.ConclusionTFL can improve the liver function in model rats with cholestatic liver fibrosis and reduce liver fibrosis,which may be related with inhibitory effects on the expressions of p16,PC3 and PCⅠ.

total flavone from litchi chinensis sonn;cholestatic liver fibrosis;PCⅠ;PC3;p16

R575.5 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.010

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：81360659）；广西壮族自治区教育厅科研资助项目（项目编号：201012MS172）;广西壮族自治区自然科学基金项目（项目编号：2012GXNSFAA053105）

1桂林医学院附属医院消化内科（邮编541001），2检验科；3桂林医学院公共卫生学院；4桂林医学院药学院

△通讯作者 E-mail：zyz-1968@163.com