过氧化氢对游离线粒体Cyt-c释放的影响*

李小倩 冯润荷 李 静 唐向东

过氧化氢对游离线粒体Cyt-c释放的影响*

李小倩1冯润荷2△李 静1唐向东1

目的在线粒体水平探讨过氧化氢（H2O2）预处理对游离线粒体细胞色素c（Cyt-c）释放的影响，揭示缺血预适应（IPC）对缺血再灌注（IR）损伤的作用机制。方法分离大鼠肝脏线粒体，制成游离线粒体。将游离线粒体分为5组，（1）为对照（C）组、（2）～（5）组分别加入12.5、25、50和100 µmol/L的Ca2+，刺激游离线粒体10 min，检测游离线粒体Cyt-c，胱氨酸酶激活剂（Smac）的释放量。建立游离线粒体IPC再灌注模型，将游离线粒体分为7组，C组、IR组、加H2O2组共7组，对加H2O2组分别加入2 µL H2O2，终浓度分别为1、2、5、20和100 µmol/L；在H2O2处理后，再用100µmol/L Ca2+对IR组、加H2O2组模拟再灌注，检测Cyt-c的释放量，再对IR组和H2O2终浓度为1和2µmol/L组检测心磷脂活性的变化。结果与C组比较，Ca2+浓度25、50和100µmol/L组Cyt-c、Smac的释放量显著增高（P＜0.05）。与IR组比较，H2O2浓度1、2µmol/L组Cyt-c的释放量明显减少（P＜0.05）。Cyt-c释放减少时可改变心磷脂的活性。结论低浓度H2O2预处理通过使Cyt-c与心磷脂结合得更加紧密，而使线粒体在高Ca2+（100µmol/L）刺激后Cyt-c释放量减少，阻滞了凋亡途径的发生，是IPC对缺血再灌注损伤发挥效应的关键因素。

过氧化氢；细胞色素c；再灌注损伤；钙超载；线粒体通透性转换孔

缺血预适应（IPC）是广泛存在的内源性保护机制，存在于多种器官系统，如心脏、脑、肝脏和肾脏。虽然IPC现象已达到共识，但其确切机制尚不完全清楚，因而一直以来是缺血再灌注（IR）研究领域的一个热点问题。细胞色素c（Cyt-c）[1]、胱氨酸酶激活剂（Smac）[2]等线粒体内容物释放入胞浆而导致细胞凋亡是目前广泛接受的IR损伤机制，而IPC对IR损伤的保护机制是否与Cyt-c、Smac的释放有关尚不清楚。有研究表明，小剂量过氧化氢（H2O2）预处理能够减轻线粒体Ca2+超载，减少线粒体内膜通透性转换孔（mPTP）的开放，从而对IR损伤发挥保护作用[3]，但对相关机制争论颇多。本研究从线粒体水平探讨H2O2预处理对Cyt-c、Smac等释放的影响，旨在揭示IPC对IR损伤的作用机制，为临床预防IR损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠，SPF级，体质量（250±30）g，购自军事医学科学院实验动物中心。主要试剂H2O2、Mannitol、Sucrose、乙二醇双四乙酸（EGTA）、KH2PO4、十二烷基硫酸钠（SDS）、NaCl、Anti-Cyt-c、Smac购自Sigma-Aldrich，NAO为Invitrogen产品。电泳仪（Bio-Rad）、离心机TDL-5C型（上海安亭科学仪器厂）、流式细胞仪（BD FACSCalibur）、SW-CJ-2FB双人两用净化工作台（苏州净化）。

1.2 方法

1.2.1 线粒体分离 先将分离缓冲液（Mito I）放入-20℃的冰箱中冷冻30 min。麻醉大鼠，取适量新鲜肝脏，剪成1 cm3的小块，立即在Mito I中预冷4～5 min。称取适量肝脏组织（约0.142 g制成2.4 mL线粒体悬液），剪碎，研磨至无组织块的浑浊液体。离心10 min（4℃，600×g）后弃沉淀，将上清再离心10 min（4 ℃，12 000×g），弃上清，沉淀即为线粒体。用适量线粒体悬浮液重悬线粒体，4℃保存备用。

1.2.2 高Ca2+刺激干预Cyt-c和Smac的释放 Ca2+刺激实验：将游离线粒体分为5组，（1）为对照（C）组、（2）～（5）组分别加入 12.5、25、50 和 100 μmol/L 的 Ca2+，刺激游离线粒体 10 min。将各组线粒体离心15 min（4 ℃，14 000×g），上清按适当比例与5×上样缓冲液（loading buffer）混匀，沸水煮8 min，冰上冷却后离心5 min（3 000 r/min，4℃），-20℃保存；沉淀用200 μL全细胞提取液（RIPA）打匀，冰上放置30 min，5 min震动一次，使裂解液与线粒体充分接触，蛋白悬液按适当比例与5×loading buffer混匀，沸水煮8 min，冰上冷却后离心5 min（3 000 r/min，4 ℃），-20 ℃保存。用Western blot方法[4]检测上清液和线粒体内Cyt-c、Smac含量。

1.2.3 不同浓度H2O2干预高Ca2+刺激下Cyt-c的释放 IPC模型实验：将游离线粒体分为7组，（1）对照组（C组），2 μL线粒体重悬液至200 μL 25 min。（2）IR组，在C组的基础上加2 μL Ca2+（Ca2+终浓度100 μmol/L）10 min。3组、4组、5组、6组和7组分别加入2 μL H2O2至200 μL体系 25 min，终浓度分别为1、2、5、20和100 μmol/L，在H2O2处理后再用2 μL Ca2+（Ca2+终浓度100 μmol/L）处理10 min。Cyt-c检测方法同1.2.2。

1.2.4 小剂量H2O2对高Ca2+刺激下心磷脂活性的检测 将游离线粒体分为5组：（1）Alone空白对照组。（2）NAO同型对照组。（3）NAO Ca2+100 μmol/L 组。（4）NAO 1 μmol/L H2O2组。（5）NAO 2 μmol/L H2O2组。用流式细胞术[5]经NAO染色后检测心磷脂活性的变化，各组在1 μmol/L NAO 37℃孵育30 min，NAO仅使非氧化的心磷脂染色，NAO荧光降低表明心磷脂的氧化。用带有FACScan程序的流式细胞仪在FL1-H通道检测荧光强度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。多组比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度组Ca2+刺激游离线粒体Cyt-c、Smac释放量比较 与C组比较，25、50和100 μmol/L组Cyt-c、Smac的释放量显著增高（P ＜0.05）。12.5 μmol/L组与C组比较，Cyt-c的释放量显著增高（P＜0.05），Smac的释放量差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。25 μmol/L组与12.5 μmol/L组比较，Smac的释放量显著增高（P＜0.05），Cyt-c的释放量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Table 1 Comparison of free mitochondrial Cyt-c and Smac emissions between five groups表1 各组游离线粒体Cyt-c、Smac释放量比较（n=6，%，ˉ±s）

Table 1 Comparison of free mitochondrial Cyt-c and Smac emissions between five groups表1 各组游离线粒体Cyt-c、Smac释放量比较（n=6，%，ˉ±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与12.5 μmol/L组比较，c与25 μmol/L组比较，d与50 μmol/L组比较，P＜0.01

组别C组（1）12.5µmol/L组（2）25µmol/L组（3）50µmol/L组（4）100µmol/L组（5）F Cyt-c 0.050 3±0.001 7 0.119 7±0.009 2a0.131 8±0.012 1a0.417 9±0.011 6abc0.498 8±0.008 7abcd2 710.522＊＊Smac 0.130 1±0.023 1 0.128 9±0.002 9 0.196 0±0.002 3ab0.429 5±0.019 7abc0.682 7±0.028 3abcd998.722＊＊

2.2 H2O2及高Ca2+刺激后各组Cyt-c释放量比较 IR组与C组比较，Cyt-c的释放量显著增高（P＜0.01）。与 IR 组比较，1 μmol/L H2O2组、2 μmol/L H2O2组Cyt-c的释放量明显减少，100 μmol/L H2O2组Cyt-c的释放量显著增高（P ＜ 0.05），与5、20 μmol/L H2O2组比较Cyt-c的释放量差异无统计学意义。2 μmol/L H2O2组的Cyt-c释放量高于1 μmol/L组（P＜0.05），20 μmol/L与100 μmol/L H2O2组的Cyt-c释放量差异无统计学意义，见表2。

Table 2 Comparison of free mitochondrial Cyt-c emissions between different IPC model groups表2 IPC模型组游离线粒体Cyt-c释放量比较（n=6，%，ˉ±s）

Table 2 Comparison of free mitochondrial Cyt-c emissions between different IPC model groups表2 IPC模型组游离线粒体Cyt-c释放量比较（n=6，%，ˉ±s）

＊＊P＜0.01

P组别C组（1）IR组（2）1 μmol/L H2O2组（3）2 μmol/L H2O2组（4）5 μmol/L H2O2组（5）20 μmol/L H2O2组（6）100 μmol/L H2O2组（7）F Cyt-c 0.139 1±0.102 6 0.664 4±0.095 7 0.280 0±0.182 6 0.471 3±0.066 1 0.575 7±0.081 7 0.765 2±0.113 0 0.793 0±0.095 6 29.572＊＊统计学处理组比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（2）∶（7）（3）∶（4）（6）∶（7）＜0.001 0.137 0.001 0.004 0.119 0.133 0.044 0.039 0.656

2.3 H2O2预处理对心磷脂与Cyt-c亲和力的影响 NAO Ca2+100 μmol/L组的荧光强度低，心磷脂被氧化，氧化的心磷脂与Cty-c亲和力下降，其他各组荧光强度明显高于NAO Ca2+100 μmol/L组，证实小剂量H2O2可以逆转高Ca2+引起的心磷脂活性的改变，心磷脂与Cty-c亲和力增加，见图1。

Figure 1 Activity changes of mitochondrial IPC model cardiolipin图1 线粒体IPC模型心磷脂的活性变化

3 讨论

3.1 Cyt-c、Smac的释放量对Ca2+浓度具有依赖性 线粒体Cyt-c释放是导致细胞凋亡的关键因素。正常情况下，Cyt-c存在于线粒体内外膜之间的膜间隙中，与线粒体内膜的心磷脂结合，不能漏出外膜；在严重缺血缺氧情况下，线粒体外膜破裂，Cyt-c从线粒体释放入胞浆，导致细胞凋亡。Smac是一种存在于线粒体内外膜之间能调节细胞凋亡的蛋白，Smac从线粒体释放入胞浆，与胞浆中凋亡抑制蛋白（IAPs）接触，拮抗IAPs对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的抑制作用；Smac又可以促进前caspase-3水解，增强caspase-3的活性，促进细胞凋亡[6]。在钙超载尤其伴有过氧化刺激时，线粒体mPTP打开，导致线粒体基质增加，外膜破裂，从而使得Cyt-c、Smac等释放入胞浆中，导致细胞凋亡，这是被广泛接受的缺血再灌注损伤的主要机制。本研究用外源的Ca2+刺激线粒体来模拟mPTP开放过程，结果显示不同浓度Ca2+引起Cyt-c、Smac的释放量不同，随着Ca2+浓度增大，Cyt-c、Smac释放量增加，而且具有浓度依赖性。Ca2+浓度为12.5 μmol/L时，mPTP已经开放，Ca2+浓度小于12.5 μmol/L时，Cyt-c、Smac几乎不释放，对线粒体基本无重要伤害，而100 μmol/L Ca2+对线粒体的伤害已经不可逆转，表明100 μmol/L Ca2+模拟再灌注是可靠的。

3.2 小剂量H2O2可减少高Ca2+诱导的Cyt-c的释放量 众所周知，缺血再灌注损伤伴随着线粒体内钙超载和过氧化的刺激，导致线粒体功能紊乱和细胞凋亡。Cyt-c释放是导致细胞凋亡的关键因素，Cyt-c的释放机制及其在缺血再灌注损伤中的作用是近年来研究的热点。而线粒体水平缺血预适应后，再灌注时Cyt-c的释放情况尚不清楚。本研究用外源H2O2预处理游离线粒体，再用高Ca2+（100 μmol/L）模拟再灌注，结果显示当H2O2浓度为1、2 μmol/L时可明显减少高Ca2+刺激的Cyt-c释放，而100 μmol/L的H2O2可使Cyt-c的释放量显著增高，表明低浓度H2O2预处理可减少高Ca2+诱导的Cyt-c释放，减轻线粒体伤害和再灌注损伤，而高浓度H2O2则协同高Ca2+加重线粒体伤害。

3.3 线粒体水平IPC的保护机制 心磷脂是位于线粒体内膜上带负电荷的磷脂，影响电子传递链中各种酶的活性；具有氧化特性的心磷脂通过调节caspase-8的活性，影响Cyt-c的释放，所以与细胞凋亡机制有关。研究表明，降低心磷脂的含量或氧化心磷脂的不饱和脂肪酸都会影响Cyt-c与线粒体的结合，而应用抗氧化剂处理具有还原作用的蛋白，能减少Cyt-c的释放，活性氧自由基（ROS）可以影响心磷脂氧化状态，氧化的心磷脂与Cyt-c亲和力下降，而非氧化心磷脂与Cyt-c亲和力增强，可抑制Cyt-c释放[7]。本次实验假设外源低浓度H2O2（ROS的一种）对高Ca2+引起的Cyt-c的释放有抑制作用，其机制可能是Cyt-c与线粒体内膜上的心磷脂结合得更紧密，从而阻滞了Cyt-c释放。为证实这一假设，笔者应用NAO染料检测心磷脂的活性。结果显示高Ca2+组NAO荧光强度低，表明心磷脂氧化，与Cyt-c亲和力下降，小剂量H2O2组荧光强度增强，表明氧化的心磷脂被逆转，与Cyt-c亲和力增强，可抑制Cyt-c释放。因此，外源低浓度H2O2确实可以逆转高Ca2+引起的心磷脂活性的改变。

综上所述，在线粒体水平，IPC对缺血再灌注损伤的作用机制在于：低浓度H2O2预处理线粒体后，使Cyt-c与心磷脂的结合力增加，而使线粒体在高Ca2+（100 μmol/L Ca2+）刺激后Cyt-c释放量减少，阻滞了凋亡途径的发生；而高浓度H2O2则协同高Ca2+加重线粒体伤害，故可以用“毒物兴奋效应”来解释IPC的机制，为其研究提供出新的思路。对于H2O2作用于整个细胞，本研究显示，低浓度H2O2能够明显减轻大鼠心肌细胞系（H9C2）缺氧复氧损伤，这一结果也能在大鼠原代心肌细胞（ARVM）上得到重复[8]，从而为心肌缺血再灌注损伤的预防提供理论依据和潜在的新药靶点。对于其他细胞如脑、肾脏等，还需要以后进行深入的研究。

[1] 陈胜,彭沪,庄育刚,等.盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡和细胞色素C释放的影响[J].同济大学学报,2012,33（6）:36-40.

[2]郭丽君，袁慧欣，阚卫军，等.重组人红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后XIAP及Smac蛋白表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2011,9（1）:69-70.

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[8]李静，冯润荷，唐向东，等.小剂量过氧化氢预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国应用生理学杂志,2013,29（3）:251-254.

（2013-05-22收稿 2013-11-01修回）

（本文编辑 李鹏）

Effect of Hydrogen Peroxide on Free Mitochondrial Cytochrome-c Release

LI Xiaoqian1,FENG Runhe2,LI Jing1,TANG Xiangdong1
1 Nankai University School of Medicine,Tianjin 300071,China;2 Tianjin Medical College

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen peroxide(H2O2)pretreatment on free mitochondrial cytochrome c(Cyt-c)release in mitochondrial levels,and reveal the mechanism of the ischemic preconditioning(IPC)on the ischemia reperfusion(IR)injury thereof.MethodsThe rat liver mitochondria was isolated and made free mitochondria.Free mitochondria were divided into 5 groups:control group(C)and different concentrations of Ca2+groups(12.5,25,50 and 100µmol/L).The levels of Cyt-c and second mitochondria-defived activator of caspase(Smac)were detected after 10 min stimulation of free mitochondria.The free mitochondrial IPC reperfusion model was made and divided into seven groups:C group,IR group and different concentrations of H2O2groups(2µL H2O2in 200µL system respectively,final concentration of 1,2,5,20 and 100µmol/L respectively).100µmol/L Ca2+was used again on the simulation of IR group.The level of Cyt-c release was detected.The changes in the activity of cardiolipin were detected in IR group and H2O2(1 and 2µmol/L of final concentration)groups.ResultsCompared with C group,there were significantly higher levels of Cyt-c and Smac emission in 25,50,and 100µmol/L Ca2+groups(P＜0.05).Compared with IR group,there was significantly decreased level of Cyt-c emission in H2O2(1 and 2µmol/L)groups(P＜0.05).The activity of cardiolipin was changed when reducing release of Cyt-c.ConclusionCyt-c was bonded with cardiolipin more closely when the low concentration of H2O2pretreatment in mitochondria.There was a lower level of Cyt-c emission in mitochondria after stimulation with high concentration of Ca2+(100µmol/L Ca2+).The blocking apoptotic pathway plays a key fact in the effect of IPC on IR injury.

hydrogen peroxide；cytochromes c；reperfusion injury；calcium overload；mitochondrial permeability transition pore

R363，R966 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.009

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：81072629）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：10JCYBJC14800）；天津市高等学校科技发展基金项目（项目编号：20100115）

1南开大学医学院（邮编300071）；2天津医学高等专科学校

△通讯作者 E-mail:fengrunhe@163.com