Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响*

朱德淼 刘学政

Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响*

朱德淼1刘学政2△

目的探讨Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的影响及机制。方法SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导30只糖尿病模型。分为对照组、糖尿病组、siNgR组、siRNA空白组，每组10只。siNgR组糖尿病大鼠玻璃体内注射Nogo受体反义核苷酸序列；siRNA空白组糖尿病大鼠玻璃体内注射阴性核苷酸序列。1个月后，免疫荧光组化检测Nogo受体与RGC标志物Brn3a的共存；以TUNEL染色观察RGC凋亡；试剂盒检测视网膜丙二醛（MDA）含量；Western blot检测视网膜Nogo受体及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表达。结果Nogo受体大量表达于视网膜RGC内，对照组、糖尿病组、siRNA空白组及siNgR组MDA含量分别为（3.68±0.47）、（8.07±1.24）、（7.54±1.53）及（5.12±0.62）μmol/g蛋白，RGC凋亡率分别为（5.1±0.2）%、（49.3±2.7）%、（45.6±1.8）%及（12.4±0.6）%，Nogo受体相对表达量分别为（0.18±0.07）%、（0.45±0.12）%、（0.40±0.09）%及（0.16±0.09）%，caspase-3相对表达量分别为（0.16±0.05）%、（0.40±0.18）%、（0.42±0.12）%及（0.17±0.08）%。与对照组相比，糖尿病组及siRNA空白组视网膜RGC凋亡明显，Nogo受体及caspase-3表达上调，MDA含量增加（P＜0.05）。与糖尿病组相比siNgR组视网膜RGC凋亡减少、Nogo受体及caspase-3表达下调、MDA含量降低（P＜0.05）。结论Nogo受体表达上调参与了糖尿病视网膜RGC凋亡，其机制可能与Nogo受体上调caspase-3表达、诱发视网膜氧化应激有关。

糖尿病；视网膜神经节细胞；RNA,小分子干扰；细胞凋亡；丙二醛；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；疾病模型,动物；Nogo受体

糖尿病可导致患者视功能受损，出现视力减退、视物模糊，甚至失明等症状。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）轴突是视神经的主要成分，RGC凋亡是患者视力减退的重要机制之一[1]。Nogo受体具有抑制神经再生的作用，在RGC内大量表达[2]。但糖尿病时Nogo受体在RGC内的表达变化以及对RGC的影响尚不清楚。因此，本研究拟探讨Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜RGC的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 40只SD大鼠雌雄不限，体质量200～230 g，购自辽宁医学院实验动物中心；siNgR慢病毒包装液购自上海吉玛生物公司；TUNEL及丙二醛（MDA）试剂盒购自北京碧云天生物公司；Nogo受体及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 SD大鼠以60 mg/kg剂量腹腔注射2%链脲佐菌素，48 h后测尾静脉血糖＞16.7 mmol/L即为糖尿病模型，共30只。通过抽签方式将动物随机分为对照组、糖尿病组、siNgR组和siRNA空白组，每组10只。其中siNgR组糖尿病大鼠玻璃体内注射10 μL慢病毒包装的Nogo受体反义核苷酸序列；siRNA空白组糖尿病大鼠玻璃体内注射10 μL慢病毒包装的阴性核苷酸序列；对照组不施加处理因素。1个月后进行指标检测。

1.2.2 视网膜Nogo受体及Brn3a免疫荧光组化双重标记染色 常规制备视网膜石蜡切片，脱蜡至水。以羊抗兔Nogo受体/小鼠抗大鼠Brn3a混合液于4℃孵育48 h，二者浓度均为 1∶200（Brn3a为RGC特异性标志物），再以A594-驴抗羊/A488-驴抗小鼠混合液孵育4 h（浓度均为1∶500），封片，荧光显微镜下观察。

1.2.3 Western blot检测Nogo受体及caspase-3表达 制备视网膜匀浆，裂解组织后以12 000 r/min离心15 min，将上清液电泳后电转移至PVDF膜，以Nogo受体、caspase-3及β-actin一抗分别37℃孵育2 h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温分别孵育1 h，试剂盒显影，以β-actin为内对照，检测目的蛋白相对显影强度。

1.2.4 视网膜MDA含量检测 以生理盐水制备5%视网膜组织匀浆，4 000 r/min离心10 min后取上清，按试剂盒中的操作步骤及公式计算视网膜中MDA的含量。

1.2.5 视网膜TUNEL染色 常规制备视网膜石蜡切片，按照试剂盒说明书操作。封片后显微镜下观察，每个视网膜随机读取3个视野，计数TUNEL阳性细胞（棕色）及RGC数目各3次，取平均值，计算各组视网膜TUNEL细胞阳性率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间资料比较行单因素方差分析，进一步组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nogo受体在RGC内的表达 Brn3a与Nogo受体进行免疫荧光组化双标显示，二者于视网膜内大量共存，见图1。

2.2 Nogo受体及caspase-3在糖尿病大鼠视网膜的表达 4组Nogo受体及caspase-3相对表达量差异有统计学意义（均P＜0.01）。与对照组相比，糖尿病组及siRNA空白组视网膜Nogo受体及caspase-3表达上调（均P＜0.01），siNgR组Nogo受体及caspase-3表达无明显变化（均P＞0.05），见表1、图2。

Table 1 Comparison of expressions of Nogo receptor and caspase-3 between four groups表1 各组Nogo受体及caspase-3相对表达量比较（n=10,±s）

Table 1 Comparison of expressions of Nogo receptor and caspase-3 between four groups表1 各组Nogo受体及caspase-3相对表达量比较（n=10,±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比P＜0.01

组别对照组糖尿病组siRNA空白组siNgR组F Nogo受体相对表达量0.18±0.07 0.45±0.12a0.40±0.09a0.16±0.09 205.481＊＊caspase-3相对表达量0.16±0.05 0.40±0.18a0.42±0.12a0.17±0.08 218.392＊＊

Figure 2 Expressions of retinal Nogo receptor and caspase-3 in four groups图2 各组视网膜Nogo受体及caspase-3蛋白表达

2.3 Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜氧化应激的影响 对照组、糖尿病组、siRNA空白组及siNgR组视网膜MDA含量分别为（3.68±0.47）、（8.07±1.24）、（7.54±1.53）及（5.12±0.62）μmol/g蛋白，组间差异有统计学意义（F=265.858，P＜0.01）。糖尿病组及siRNA空白组较对照组明显增加，siNgR组较糖尿病组明显降低（均P＜0.01）。

2.4 Nogo受体对糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的影响 TUNEL染色显示，1个月后对照组、糖尿病组、siRNA空白组及siNgR组TUNEL细胞阳性率分别为（5.1±0.2）%、（49.3±2.7）%、（45.6±1.8）%及（12.4±0.6）%，组间差异有统计学意义（F=357.481，P ＜0.01）。糖尿病组及siRNA空白组较对照组明显增加（均P＜0.01），siNgR组较糖尿病组明显减少（P＜0.01），见图3。

3 讨论

糖尿病可并发视网膜病变，是成年人致盲的重要因素之一。其主要病理表现为视网膜微血管病变及视网膜神经系统病变。糖尿病早期，包括RGC在内的视网膜神经元、神经胶质细胞结构及功能均可发生明显的病理变化，是患者视力受损、视力下降的重要因素[1]。

3.1 Nogo受体表达上调对RGC凋亡的影响 Nogo受体的激活是抑制神经再生，促进神经元凋亡的重要因素之一[3]。Nogo受体广泛表达于神经系统，但在大鼠视网膜各层神经组织中，Nogo受体仅表达于RGC细胞[2]，本研究也证实了这一点，Brn3a是RGC的特异性标志物，Brn3a/Nogo受体免疫荧光组化双标发现，Brn3a与Nogo受体在视网膜内大量共存，Nogo受体仅表达于视网膜RGC内。Nogo受体与RGC的损伤后再生关系密切，青光眼时可见视网膜内RGC细胞Nogo受体表达明显上调，抑制Nogo受体表达可恢复视网膜突触功能，抑制RGC细胞凋亡[4]。因此，Nogo受体表达增加是促进视网膜RGC凋亡、突触功能减退的重要机制之一。本研究发现，糖尿病大鼠视网膜内Nogo受体增加的同时，RGC细胞发生了明显凋亡，而siNgR组的Nogo受体表达及RGC细胞凋亡率均低于糖尿病组，结果提示利用siRNA下调Nogo受体表达可抑制糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡。

3.2 Nogo受体诱导视网膜RGC凋亡的机制 Nogo受体诱导糖尿病视网膜RGC凋亡的机制尚不完全清楚。Nogo-A是Nogo受体的配体。研究发现，Nogo-A可影响心肌细胞线粒体膜电位，促进心肌细胞钙离子超载及氧自由基堆积，并上调caspase-3的表达，从而诱导心肌细胞凋亡[5]。因此，Nogo受体可能通过上述途径诱导RGC细胞凋亡。高血糖是糖尿病的显著特征，可诱发氧化应激，MDA水平是视网膜氧化应激的重要指标之一。本实验证实，糖尿病时视网膜MDA水平增高，视网膜发生了明显的氧化应激，抑制Nogo受体表达可降低视网膜MDA含量，并降低糖尿病大鼠视网膜氧化应激水平。视网膜内凋亡相关基因caspas-3表达增加是糖尿病视网膜病变的重要分子机制之一[6]。本研究发现，抑制Nogo受体可显著下调视网膜caspase-3表达。因此，Nogo受体可能通过上调视网膜内caspase-3表达，从而诱导糖尿病视网膜RGC凋亡。

3.3 研究意义及展望 本研究证实了Nogo受体上调是糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的重要因素，其机制可能与Nogo受体诱导视网膜RGC氧化应激、上调caspase-3表达有关。但是，视网膜氧化应激及凋亡与高血糖状态、糖基化终产物堆积、胰岛素缺乏、视网膜局部神经营养因子相对不足等多种因素密切相关[7]。此外，Nogo受体也可能通过调节谷氨酸受体的表达及活化参与凋亡[8]。RGC凋亡是糖尿病视网膜病变的重要原因，Nogo受体参与了RGC凋亡的发生，但其中机制仍有待进一步探索，积极探讨RGC凋亡机制，对于糖尿病视网膜病变的临床治疗具有重要意义。

Figure 1 Colocalization of Nogo receptor and Brn3a in retina(immunofluorescence histochemical double-staining，×200)图1 Nogo受体与Brn3a在视网膜内的共存（荧光免疫组化双重标记，×200）

Figure 3 TUNEL-positive RGC in four groups(×200)图3 各组视网膜TUNEL染色阳性RGC（×200）

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（2013-05-06收稿 2013-08-29修回）

（本文编辑 李鹏）

The Role of Nogo Receptor on the Apoptosis of Retinal Ganglion Cells in Diabetic Rats

ZHU Demiao1,LIU Xuezheng2
1 Department of Basis of Integrative,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100032,China；2 Department of Human Anatomy,Liaoning Medical University

ObjectiveTo investigate the effect of Nogo receptor on the apoptosis of retinal ganglion cell(RGC)in diabetic rats,and the potential mechanism thereof.MethodsThirty diabetic model rats were induced by intraperitoneal administration of streptozotocin.Model rats were randomly divided into control group,diabetes mellitus(DM)group,siNgR group and siRNA control group(n=10 for each group).Diabetic rats in siNgR group were intravitreally administrated with Nogo receptor antisense nucleotide.Diabetic rats in siRNA control group were intravitreally administrated with negative nucleotide.One month after diabetes onset,colocalization of Nogo receptor and Brn3a(marker of RGC)was observed by immunohistochemistry.The apoptosis of RGC was detected by TUNEL staining.The level of retinal malondialdehyde(MDA)was observed with kit,and the expressions of Nogo receptor and caspase-3 were detected with Western blot assay.ResultsIt was found that the Nogo receptor was highly expressed in RGC.The levels of retinal MDA were(3.68±0.47),(8.07±1.24),(7.54±1.53)and(5.12±0.62)μmol/g protein for control group,DM group,siRNA control group and siNgR group.The apoptotic rates of RGC were(5.1±0.2)%,(49.3±2.7)%,(45.6±1.8)%and(12.4±0.6)%respectively.The expressions of Nogo receptor were(0.18±0.07)%,(0.45±0.12)%,(0.40±0.09)%and(0.16±0.09)%.The expressions of caspase-3 were(0.16±0.05)%,(0.40±0.18)%,(0.42±0.12)%and(0.17±0.08)%.Compared with control group,there was significant increase in apoptosis of RGC,significantly up-regulated expressions in Nogo receptor and caspase-3,and significantly increased level of MDA in DM group and siRNA control group(P＜0.05).Compared with DM group,there were decreased apoptotic rate of RGC,decreased expressions of Nogo receptor and caspase-3,and decreased level of retinal MDA in siNgR group(P＜0.05).ConclusionThe increased level of Nogo receptor induces oxidative stress and up-regulation of caspase-3 in diabetic retina,playing an important role in the apoptosis of RGC.

diabetes mellitus；retinal ganglion cells；RNA,small interfering；apoptosis；malondialdehyde；caspase 3；disease models,animal；Nogo receptor

R741.02，R-332 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.008

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：31140072）；辽宁省科技厅资助项目（项目编号：2011225015）

1辽宁中医药大学中西医结合基础学科（邮编100032）；2辽宁医学院人体解剖学教研室

△通讯作者 E-mail：liuxuezheng168@vip.sina.com